一种Psme3条件性基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种Psme3条件性基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用。所述Psme3条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，是利用Cas9/RNA system gene targeting技术，将Psme3基因的第3～5外显子敲除，从而实现整个基因失活，获得了Psme3基因条件性敲除小鼠模型。Psme3作为蛋白酶体激活因子，调节20S蛋白酶体的水解活性，而且调控多种肿瘤相关因子降解。本发明专利技术构建得到的Psme3基因条件性敲除小鼠模型为进一步研究Psme3基因的生物学功能奠定了基础，可以为Psme3高表达的实体瘤的发生发展中的作用机制提供理想模型。提供理想模型。

【技术实现步骤摘要】
一种Psme3条件性基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于医药领域，具体涉及一种Psme3条件性基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]REGγ，又名11Sγ、PA28γ、PSME3或Ki(GeneID：10197)，是11S蛋白酶体激活因子家族成员之一，最初是在系统性红斑狼疮病人的血清中发现的，并命名为Ki抗原，但其与系统性红斑狼疮病人的关系至今依旧没有十分明确。之后的研究发现Ki抗原与REGα和REGβ一样，属于11S蛋白酶体激活因子家族成员，因其是在REGα和REGβ之后发现的，所以被命名为REGγ。
[0003]REGγ作为蛋白酶体激活因子，通过与20S核心颗粒的α亚基结合，打开20S门控，将底物蛋白送入20S的β亚基蛋白酶催化位点处，将底物蛋白降解。REGγ-20S蛋白质降解系统对底物蛋白降解的过程不需要泛素化和ATP的参与，是一个泛素和ATP非依赖的蛋白质降解系统。REGγ-20S蛋白质降解系统通过降解一些具有重要生物学功能的蛋白质来调控一系列生理生化过程。例如，通过降解肿瘤抑制因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Psme3条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)利用Cas9/RNA system gene targeting技术，构建针对小鼠Psme3基因的gRNA；(2)构建重组打靶载体：根据sgRNA设计相应的donor，构建donor质粒，制作携带loxp片段的Donor质粒，将其纯化用于注射；(3)原核注射及移植：小鼠的超排；注射受精卵、移植；得到F0代小鼠；(4)F0代小鼠鉴定及繁育：通过PCR和测序验证、筛选阳性F0代小鼠；将阳性F0代小鼠和C57BL/6J回交；(5)F1代小鼠鉴定：通过PCR和测序验证、筛选阳性小鼠；然后将F1代小鼠与C57BL/6J背景鼠进行互交扩繁得到F2代，先使用1号引物对鉴定，筛选阳性F2代小鼠，再用5号、7号和8号引物对进行PCR鉴定；(6)F2代杂合子后，进行兄妹配，使用如步骤(5)所述的1号引物对进行PCR鉴定，得到F3代纯合子小鼠，即为具有Psme3 Cas9-CKO条件性基因敲除的小鼠模型。2.根据权利要求1所述的Psme3条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，根据Psme3基因序列，设计1对Psme3基因的单链向导RNA；sg RNA-5S:5
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AGTGGTGATGGTTAATAGCT-3
’
(SEQ ID No.1)；sg RNA-3S:5
’-
GGTATCCAACCAGACCCTCC-3
’
(SEQ ID No.2)。3.根据权利要求1所述的Psme3条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述构建重组打靶载体，具体操作如下：制作携带靶位点同源区域以及loxP位点的片段的重组质粒Donor vector，将重组质粒转化到DH5a感受态细胞中，通过氨苄抗性以及插入片段的测序，对阳性克隆质粒进行筛选及鉴定，挑选正确的菌落克隆，扩大培养后提取质粒并纯化，获得的donor片段产物用于注射使用。4.根据权利要求1所述的Pmse3条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，将带loxp片段的Donor vector与Cas9 system共注射至受精卵，在Cas9 system切开目的DNA链后，通过同源重组将loxp片段重组到靶位点上。5.根据权利要求1所述的Psme3条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(5)中，PCR鉴定时，1号引物对序列分别为：Psme3-loxPtF1：5
’-
AATTTCAAGGTGAGGGCGAGACAG-3
’
(SEQ ID No.3)，Psme3-loxPtR1：5
’-
AATAAACGTGGGACAGTCCCTCACT-3
’
(SEQ ID No.4)，目的片段为Fl：307bp Wt：216bp；touch down PCR反应条件为：95℃5min，98℃30s，65℃30s(-0.5℃)，72℃45s(98℃-72℃，20个循环)，95℃30s，55℃30s，72℃45s(95℃-72℃，20个循环)，72℃5min，10℃hold。6.根据权利要求1所述的Psme3条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(5)中，PCR鉴定时，3
’
等位基因的5号引物对序列分别为：PNF：5
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ATCCGGGGGTACCGCGTCGAG-3
’
(SEQ ID No.5)，Psme3-D-3in-tR1：5
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ACCACCTCAGATCACAA-3
’
(SEQ ID No.6)，目的片段为Flox：3582bp Wt：none，touch down PCR反应条件为：95℃5min，98℃30s，65℃30s(-0.5℃)，72℃45s(98℃-72℃，20个循环)，95℃30s，55℃30s，72℃45s(95℃-72℃，20个循环)，72℃5min，10℃hold。
7.根据权利要求1所述的Psme3条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(5)中，PCR鉴定时，5
’
臂的7号引物对序列分别为：Psme3-D-5in-tF2：5
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ACTGAGTATCAGAGCGGCTGCGC-3

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓涛，沈诗慧，李磊，童璐，高晓，祝恩浩，杜营营，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：