一种应用非病毒方法制备高纯度嵌合抗原受体修饰的T细胞的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种利用转座子系统和人工抗原呈递细胞制备高纯度NKG2D嵌合抗原受体修饰的T细胞的方法及其应用，所述方法包括：(1)利用piggyBac转座子系统将NKG2D嵌合抗原受体的编码基因转入T细胞，得到初始的NKG2D嵌合抗原受体修饰的T细胞；(2)将所述初始的NKG2D嵌合抗原受体修饰的T细胞与人工抗原呈递细胞共培养。本发明专利技术采用非病毒的方法，利用piggyBac转座子系统和K562人工抗原呈递细胞制备、扩增和富集嵌合抗原受体修饰的T细胞，材料简单、生产周期短、生产成本低、重复性好、安全性高、NKG2D CAR纯度高达90％以上、对肿瘤细胞具有显著的杀伤作用，同时可以抑制肿瘤细胞生长。由于多种肿瘤细胞高表达NKG2D配体，本发明专利技术在肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景。肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景。肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种应用非病毒方法制备高纯度嵌合抗原受体修饰的T细胞的方法及其应用


[0001]本专利技术属于医学生物工程
，具体涉及一种利用非病毒转座子系统和人工抗原呈递细胞制备高纯度嵌合抗原受体修饰的T细胞的方法及其应用。

技术介绍

[0002]免疫疗法在癌症治疗中展现出了巨大的潜力，被认为是最有希望攻克癌症的方法，其中嵌合抗原受体(CAR)修饰的免疫细胞是目前的热门研究领域。基于CAR修饰的T(CAR-T)细胞的治疗方法是将患者的T细胞重新定向到特定的肿瘤细胞，并摧毁肿瘤细胞的方法。CAR是一种基因工程融合蛋白，主要由抗原识别区域和胞内信号转导区域组成。目前，CAR-T在治疗B细胞恶性肿瘤中得到了广泛的研究，其中诺华和凯特的anti-CD19 CAR-T已经被FDA批准用于治疗急性淋巴细胞白血病和大B淋巴细胞癌。越来越多的研究者开始探索CAR-T在实体肿瘤治疗中的应用前景。
[0003]由于NKG2D能够识别MIC和ULBP家族中8个在癌细胞中明显上调的相关配体，NKG2D CAR在过去几年中受到了越来越广泛的关注。在MIC家族中，由于等位基因的多态性，人类第6号染色体上的MICA和MICB基因编码大约105个蛋白质变体，这些蛋白质变体都可以被NKG2D受体识别。ULBP家族成员是一类由6号染色体上的RAET1基因编码的糖蛋白，目前已经确定了6种功能蛋白ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6。总体来说，NKG2D配体在正常组织中不广泛表达，但是在恶性转化、病毒感染或DNA损伤的细胞中表达水平升高。流行病学研究估计，高达95％的实体肿瘤至少表达一种NKG2D配体。因此，这两种现象暗示可以采用以NKG2D为基础的嵌合抗原受体靶向实体肿瘤。
[0004]CAR-T细胞的制备一般包括T细胞分离、活化、CAR基因转移、细胞扩增和灌装冻存等步骤。其中，CAR基因转移是最为关键的一步，因此CAR-T疗法依赖于高效、稳定和安全的基因转移平台。自20世纪七八十年代以来，基因转移技术已经从简单的物理化学实验室方法迅速发展到目前可应用于临床的病毒和非病毒方法。这些方法的最终目标是在没有明显毒性或致癌事件的情况下实现高效的转基因表达。在CAR-T细胞的制备过程中，常用的基因转移方法包括慢病毒载体方法和逆转录病毒载体方法。由于慢病毒载体比逆转录病毒载体具有更加安全的整合位点，因此常用于构建CAR-T细胞。利用慢病毒载体制备CAR-T，其CAR转基因在终产品中的表达比例为40％～60％。NKG2D CAR-T目前的制备方法主要也是通过慢病毒载体将NKG2D CAR的编码基因转移至T细胞中。然而，由于病毒载体本身具有致病原性和插入突变的潜力，对人类临床试验的实施构成了重大的监管障碍。不仅如此，在细胞系中大规模制造病毒载体存在成本高、效率低的问题，对CAR-T的临床转化构成了障碍，显著提高了CAR-T的生产成本。
[0005]为了克服病毒载体系统的上述局限性，研究者进一步探索了非病毒载体的可行性。通常，非病毒载体系统为人工合成系统，不依赖于任何病毒成分或哺乳动物细胞进行生产制造，成本低，同时有利于避免使用病毒载体带来的免疫问题。DNA转座子是一种典型的
非病毒载体系统，具有基因可持续性表达、免疫原性低、成本低、效率高等优点。
[0006]在自然界中，DNA转座子是包含转座酶基因的离散DNA片段，其两侧是包含转座子结合位点的反向末端重复序列(ITRs)。转座的过程为转座酶结合到TIRs上，从一个位置“剪切”转座，并“粘贴”到另一个新的位置。基于转座子的载体系统，如睡美人(SB)系统、piggyBac(PB)系统、Tol转座子系统，是利用转座的方法，将转基因引入到宿主基因组。与逆转录病毒载体类似，稳定的基因组整合到宿主中可以实现长期高效的转基因表达。PB转座子元件首先在甘蓝蠖度尺蛾被发现，后来被证实在其他物种中也具有交叉功能。PB转座酶通过识别转座子载体上的反向末端重复序列(ITRs)和基因组中相应的TTAA序列，介导载体和宿主基因组之间的遗传物质交换，因此，由ITRs支持的转基因可以稳定地整合到TTAA整合位点。重要的是，PB转座酶可以在切除后将TTAA序列恢复到原来的序列，这允许在需要时移除转基因转座，而不会对宿主基因组产生进一步影响。SB和PB转座子都已成功用于修饰T细胞，使其表达CD19特异性CAR。然而目前转座子介导的基因转移的局限性是细胞携带转基因的比例低或细胞扩增倍数少，对临床上CAR-T有效的发挥肿瘤细胞杀伤作用构成了障碍。

技术实现思路

[0007]为了克服目前NKG2D CAR-T生产制备中使用慢病毒造成的监管障碍、生产成本高的问题，或使用转座子系统造成的CAR-T细胞比例低、CAR-T细胞扩增效率有限等问题，本专利技术提供了一种联合使用转座子系统和人工抗原呈递细胞制备高纯度NKG2D嵌合抗原受体基因修饰的T细胞的方法，所述方法包括：
[0008](1)利用piggyBac(PB)转座子系统将编码NKG2D嵌合抗原受体(CAR)的基因转入T细胞；
[0009](2)利用人工抗原呈递细胞富集扩增NKG2D嵌合抗原受体基因修饰的T细胞。
[0010]所述T细胞可以来自人的外周血、脐带血或诱导性多能干细胞(iPSC)等。
[0011]优选地，步骤(1)所述PB转座子系统包括辅助载体和供体载体；所述辅助载体包括CMV启动子和PB转座酶编码基因，由质粒编码；所述供体载体包括PB转座子5
’
反向末端重复序列(5
’
ITR)和3
’
反向末端重复序列(3
’
ITR)，在5
’
ITR和3
’
ITR之间设有两个鸡β-珠蛋白染色质绝缘子cHS4，在两个绝缘子之间包括EF1α启动子和编码NKG2D CAR的基因，由质粒编码。
[0012]优选地，所述PB转座酶的氨基酸序列来自GenBank：AAA87375.2；所述PB转座子的5
’
反向末端重复序列(5
’
ITR)如SEQ ID NO:1所示，3
’
反向末端重复序列(3
’
ITR)如SEQ ID NO:2所示，鸡β-珠蛋白染色质绝缘子cHS4来自GenBank：AY040835.1；
[0013]SEQ ID NO:1：
[0014]5’-
ccctagaaagataatcatattgtgacgtacgttaaagataatcatgtgtaaaattgacgcatg-3
’
；
[0015]SEQ ID NO:2：
[0016]5’-
catgcgtcaattttacgcagactatctttctaggg-3
’
。
[0017]所述NKG2D CAR包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜区和胞内信号转导区，其中抗原结合结构域为NKG2D的胞外区域，NKG2D CA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用转座子系统和人工抗原呈递细胞制备NKG2D嵌合抗原受体修饰的T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)利用piggyBac转座子系统将NKG2D嵌合抗原受体的编码基因转入T细胞，得到初始的NKG2D嵌合抗原受体修饰的T细胞；(2)将所述初始的NKG2D嵌合抗原受体修饰的T细胞与人工抗原呈递细胞共培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述T细胞来源于外周血、脐带血或诱导性多能干细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述piggyBac转座子系统包括供体载体和辅助载体。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述供体载体包括piggyBac转座子5
’
反向末端重复序列和3
’
反向末端重复序列；所述5
’
反向末端重复序列和3
’
反向末端重复序列之间含有两个鸡β-珠蛋白染色质绝缘子cHS4；所述两个鸡β-珠蛋白染色质绝缘子cHS4之间含有NKG2D嵌合抗原受体表达框；所述NKG2D嵌合抗原受体表达框包括启动子和NKG2D嵌合抗原受体编码基因。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述辅助载体包括piggyBac转座酶表达框；所述piggyBac转座酶表达框包括启动子和piggyBac转座酶编码基因。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述供体载体和辅助载体的质量比为(1～5):1。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述NKG2D嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和胞内信号转导结构域，所述抗原结合结构域来自NKG2D的胞外段。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述piggyBac转座子系统通过电穿孔转入T细胞。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之前选择性地进行活化T细胞的步骤。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述活化T细胞采用抗体和/或抗体包被微粒进行。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述抗体包括抗人CD3抗体、抗人CD3抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖琳，裘新红，彭群武，张亮，朱苏闽，徐芳芳，吕学维，
申请(专利权)人：杭州优凯瑞医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：