一种利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的DNA系统技术方案

本发明专利技术提供了一种利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的DNA系统，所述细胞杀伤系统包括以下几个部分：1.表达核酸酶缺陷型CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的DNA系统


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体而言涉及一种利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的DNA系统。

技术介绍

[0002]RNA干扰机制
[0003]RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由单链或双链RNA(double
‑
stranded RNA，dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi具有如下特征：1)RNAi是转录后水平的基因沉默机制；2)RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA；3)RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；4)RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点；5)dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21bp左右的siRNA，并由siRNA或者miRNA来介导mRNA切割。而且大于30bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡；6)ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。
[0004]小干扰RNA(siRNA)
[0005]病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(大约21～23bp)，即siRNA(小干扰RNA，small interfering RNA)。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA
‑
induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA
‑
dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。
[0006]siRNA通常作为RNAi的工具被人工合成，但是后来发现很多生物包括线虫还有人类一些特殊的细胞也会合成内源性siRNA，以用于基因表达的调控。
[0007]微小RNA(microRNA,miRNA)
[0008]miRNA是一类长度约22个碱基的非编码小RNA，广泛存在于动物、植物和病毒中。
miRNA主要通过与AGO2等蛋白形成RNA沉默复合物(RNA
‑
induced silencing complex,RISC)在转录后水平调控基因的表达。由miRNA和AGO蛋白形成的RISC复合物通过碱基配对的方式识别目标序列，依赖于miRNA与靶标序列碱基互补的程度可以直接切割靶标RNA或者通过促进RNA降解以及抑制翻译的方式调控基因表达。
[0009]miRNA与靶标序列的识别主要依赖于种子序列(第2
‑
8位碱基)，但是其他部分的碱基也参与靶标序列的识别过程。当miRNA与靶标序列完全互补配对或者接近完全互补(除种子序列以外只有极少的错配)，可以诱导AGO2蛋白直接切割靶标序列。如果miRNA的种子序列可以完全匹配靶标序列，而其余部分的匹配程度不足以诱导AGO2切割，则会利用复杂的机制促进RNA降解以及抑制翻译过程。
[0010]目前人体细胞内发现的miRNA种类已经超过2000余种。细胞中miRNA的表达根据细胞类型和细胞状态的不同呈现高度的特异性，这种表达特异性已越来越广泛被用作细胞的特征标签，用于区别不同的细胞类型和细胞状态。以人体细胞为例，研究表明人体组织内不同类型的细胞有明显差异的miRNA表达谱，许多细胞具有高度特异性的miRNA表达，例如肝细胞中的miR
‑
122，肌肉细胞中的miR
‑
1，神经元细胞中的miR
‑
124等。研究表明，细胞内miRNA的表达组成在个体发育以及疾病发生和发展过程中均呈现高度的表达变化。
[0011]miRNA在细胞的增殖分化、新陈代谢、细胞凋亡和个体生长发育、组织器官功能以及疾病的发生发展等多种生物学过程中发挥重要的调控作用。例如，在癌症研究方面，迄今已经发现多种可以促进癌细胞生长或转移的miRNA，比如miR
‑
17/92、miR
‑
222/221、miR
‑
21、miR
‑
155等。
[0012]除了参与调控各项生命活动外，近年来miRNA在临床应用方面也受到了越来越多的关注。在治疗疾病方面，一方面通过降低病变细胞中高表达的具有促进疾病作用的miRNA的表达水平或者调控活性，可以起到抑制缓解疾病的目的。另一方面，通过向病变细胞靶向递送功能性miRNA，可以降低疾病相关基因的表达水平或者抑制免疫逃逸相关的基因，促进免疫细胞的杀伤效果。虽然利用miRNA在疾病治疗方面的应用已经取得了不少进展，但是这些研究大多处在初步研究阶段，对于其治疗效果和安全性等方面的研究还很不充分。目前对于miRNA的应用仍然是基于miRNA和靶基因之间的调控关系来实现的。但是由于每种miRNA平均可以调控数百个靶基因的表达，而每种靶基因又往往处在多种miRNA的调控之下，因而呈现出非常复杂的冗余性和关联性。因此通过降低或者递送单个或少量几个miRNA来调控致病基因的表达水平，一方面可能没有明显调控效果，另一方面可能会带来严重的副作用。突破基于miRNA和靶基因之间的调控关系的思路和方法有望避免以上缺陷，拓展miRNA的应用，并有望推动miRNA在临床治疗领域的实际应用。

技术实现思路

[0013]本专利技术人利用miRNA或siRNA介导的sgRNA释放策略创建了CRISPR
‑
Cas9平台，该平台可以被细胞内特定的miRNA或siRNA打开从而激活外源毒素基因的表达，从而靶向杀伤病变细胞。
[0014]据此，本专利技术提供了一种利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的DNA系统，所述细胞杀伤系统包括以下几个部分：1)表达核酸酶缺陷型CRISPR
‑
Cas9蛋白的质粒；2)表达前体单链引导RNA的质粒，所述前体合成引导RNA的含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列以及合成引导RNA(sgRNA)的序列；3)外源毒素基因；所述杀伤系统用于利用细胞特异性表达的miRNA或siRNA驱动外源毒素基因表达，从而实现细胞的靶向杀伤。2.根据权利要求1所述的利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的DNA系统，其中所述核酸酶缺陷型CRISPR
‑
Cas9蛋白与转录激活因子相连接。3.根据权利要求2所述的利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的DNA系统，其中所述转录激活因子为VP64、p65和Rta中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的利用RNA干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪阳明，胡鲁峰，石铭，
申请(专利权)人：南京景瑞康分子医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：