通过特异性敲除或敲低Tyk2促进心肌细胞重编程制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，特别是再生医学领域。具体而言，本发明专利技术涉及一种通过特异性敲除或敲低Tyk2促进心肌细胞重编程的方法。除或敲低Tyk2促进心肌细胞重编程的方法。

Promoting cardiomyocyte reprogramming by specific knockout or knockdown of Tyk2

【技术实现步骤摘要】
通过特异性敲除或敲低Tyk2促进心肌细胞重编程


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，特别是再生医学领域。具体而言，本专利技术涉及一种通过特异性敲除或敲低Tyk2促进心肌细胞重编程的方法。
[0002]专利技术背景
[0003]全世界2300万人患有心力衰竭，通常由心肌细胞损伤或心肌细胞功能障碍引起。心肌细胞丢失的一个常见原因是导致心肌梗死的缺血性心脏病，由于心脏再生能力有限，损伤是永久性和渐进性的。尽管在医学治疗方面取得了进展，但目前除了原位心脏移植外，还没有恢复肌肉质量的策略，而原位心脏移植受限于细胞来源数量和长期疗效。迄今为止，在人体试验中使用的细胞疗法已经证明移植的细胞不会大量变成心肌细胞，也不会在心脏中持续存在。多能干细胞来源的心肌细胞移植正在接受测试，如果在细胞存活、成熟和电生理整合等问题得到有效解决后，这可能是有价值的。利用细胞类型特异的转录因子(TF)将细胞原位重编程为在疾病中丢失的细胞类型，是一种很有希望的除细胞治疗以外的另一有效的组织再生方法。在心脏中，大量的非心肌细胞，主要是心脏成纤维细胞，可以通过转录因子转变为诱导的心肌细胞样细胞。
[0004]自第一代通过3种心脏特异性TF：GATA4、MEF2C和TBX5(GMT)的心肌细胞重编程成功问世以来，已经有很多关于增强心脏重编程效率的报道。通过改变GMT三个基因的计量学，在GMT基础上鉴定额外的基因，或者通过操纵信号通路，体外产生的心肌细胞样细胞的质量和效率都可以得到改善。在大多数情况下，效率的提高主要是在小鼠胚胎成纤维细胞中发现的；相反，对心脏成纤维细胞以及成体皮肤为起始的重编程却效果有限。尽管最近siRNA介导的bmi1基因敲除，以及通过SB431542联合XAV939的策略提高了体外心脏成纤维细胞重编程的效率，但仍有待于确定是否存在能进一步增强小鼠重编程或影响人心脏成纤维细胞重编程的方法。
[0005]因此，本领域仍然需要新的重编程方法，其能够通过重编程高效地产生功能性心肌细胞，从而治疗心脏疾病例如心力衰竭。
[0006]附图简述
[0007]图1.小分子化合物SB43152(C1)和Baricitinib(C2)的组合(2C)可以显著提高转录因子组合GMT(Gata4、Mef2c和Tbx5)介导的心肌细胞重编程效率，并且可在Gata4不存在下实现高效心肌细胞重编程。
[0008]图2.测试敲低Tyk2对心肌细胞重编程的影响的示意图。A：实验设计图，以新生鼠成纤维细胞为起始细胞，在感染转录因子MT组合和shRNA的情况下，仅在重编程培养基(加入C1)的条件下重编程为心肌细胞。B：重编程具体实验步骤。C：Tyk2的敲低效果。
[0009]图3.示出在MT+SB的情况下，通过敲低Tyk2从成纤维细胞诱导出大量心脏特异性标志物cTnI和a
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actinin阳性细胞。
[0010]图4.示出qPCR检测重编程的细胞心脏特异性标志物的表达水平。
[0011]图5.示出通过CRISPR敲除Tyk2可以促进转录因子MT以及小分子化合物C1诱导的心肌细胞重编程。
[0012]专利技术详述
[0013]本专利技术人发现通过敲低或敲除Tyk2可以促进转录因子和小分子化合物诱导的心肌细胞重编程。
[0014]因此，在一方面，本专利技术提供一种将起始细胞重编程为心肌细胞的方法，所述方法包括特异性敲低或敲除起始细胞中Tyk2的表达。
[0015]如本文所用，所述“敲低或敲除”指的是使内源Tyk2的转录水平或翻译水平上的表达消除或降低，或者指导致内源Tyk2蛋白中的突变而造成其活性的消除或降低。
[0016]本领域已知多种敲除或敲低基因表达的方法，这些都可以应用于本专利技术。在一些实施方案中，通过向所述起始细胞导入特异性靶向Tyk2的shRNA、反义RNA或siRNA来敲低Tyk2的表达。
[0017]在一些实施方案中，向所述起始细胞导入特异性靶向Tyk2的shRNA或包含编码所述特异性靶向Tyk2的shRNA的表达载体。在一些具体实施方案中，所述特异性靶向Tyk2的shRNA的编码序列包含选自SEQ ID NO:1
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3的序列。
[0018]在一些实施方案中，向所述起始细胞导入特异性靶向Tyk2的基因编辑系统。在一些实施方案中，所述特异性靶向Tyk2的基因编辑系统敲低Tyk2的表达。在一些实施方案中所述特异性靶向Tyk2的基因编辑系统敲除Tyk2的表达。在一些实施方案中所述特异性靶向Tyk2的基因编辑系统导致内源Tyk2的突变，从而减少或消除Tyk2的活性。在一些实施方案中，所述基因编辑系统是大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶或CRISPR系统。
[0019]在本专利技术方法优选的实施方案中，所述基因编辑系统是CRISPR系统。在一些实施方式中，CRISPR系统使用的核酸酶例如可以选自Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、GSU0054、Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11、Csx10、Csf1、Cas9、Csn2、Cas4、Cpf1、C2c1、C2c3或C2c2蛋白。在一些具体实施方式中，所述CRISPR系统是CRISPR/Cas9系统。
[0020]将shRNA、反义RNA或siRNA或者基因编辑系统引入细胞的方法是本领域已知的。所述shRNA、反义RNA或siRNA或者基因编辑系统组分可以直接导入细胞。但是，也可以将编码所述shRNA、反义RNA或siRNA或者基因编辑系统组分的表达载体导入细胞。
[0021]在一些实施方案中，所述方法还进一步包括使起始细胞与小分子化合物SB43152接触。
[0022]在一些实施方案中，所述起始细胞为分化的细胞。在一些实施方案中，起始细胞是非心肌细胞。起始细胞可以为中胚层来源细胞诸如心脏细胞，外胚层来源细胞诸如神经细胞，或者内胚层来源细胞如结肠细胞。在一些实施方案中，所述起始细胞为神经元细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、间质细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经细胞、造血细胞、胰岛细胞或体内几乎任何细胞。在一些实施方案中，所述起始细胞为皮肤成纤维细胞。在一些实施方案中，所述起始细胞为心脏成纤维细胞。
[0023]在一些实施方案中，所述起始细胞为分离的细胞(离体细胞)。
[0024]在本专利技术中，所述起始细胞可以来源于哺乳动物或非哺乳动物。在本专利技术的一些实施方案中，所述起始细胞来源于人。在本专利技术的一些实施方案中，所述起始细胞来源于非
人哺乳动物。在本专利技术的一些实施方案中，所述起始细胞来源于鼠如小鼠或大鼠或非人灵长类动物。
[0025]在一些实施方案中，所述重编程获得的心肌细胞是功能性心肌细胞。所述功能性心肌细胞例如具有以下特征中的一或多种：α
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actinin阳性、cTnT阳性、具有排列整齐的肌节结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种将起始细胞重编程为心肌细胞的方法，所述方法包括特异性敲低或敲除起始细胞中Tyk2的表达。2.权利要求1的方法，其中所述方法包括向所述起始细胞导入特异性靶向Tyk2的shRNA、反义RNA或siRNA，优选是特异性靶向Tyk2的shRNA，更优选地，所述特异性靶向Tyk2的shRNA的编码序列包含选自SEQ ID NO:1
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3的序列。3.权利要求1的方法，其中所述方法包括向所述起始细胞导入特异性靶向Tyk2的基因编辑系统，优选特异性靶向Tyk2的CRISPR系统。4.权利要求1
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3中任一项的方法，所述方法还进一步包括使起始细胞与小分子化合物SB43152接触。5.权利要求1
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4中任一项的方法，所述方法还包括向起始细胞提供至少一种心肌细胞诱导转录因子。6.权利要求5的方法，其中所述至少一种心肌细胞诱导转录因子选自MEF2C、TBX5、GATA4、MESP1、MYOCD、HAND2、SRF、ESRRG、ZFPM2、Nkx2.5、VEGF、Baf60c，及它们的任意组合。7.权利要求5或6的方法，其中所述至少一种心肌...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵扬，王浩，
申请(专利权)人：南京景瑞康分子医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：