改进的心肌细胞重编程方法技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，特别是再生医学领域。具体而言，本发明专利技术涉及一种改进的心肌细胞重编程方法。胞重编程方法。

【技术实现步骤摘要】
改进的心肌细胞重编程方法


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，特别是再生医学领域。具体而言，本专利技术涉及一种改进的心肌细胞重编程方法。

技术介绍

[0002][0003]全世界2300万人患有心力衰竭，通常由心肌细胞损伤或心肌细胞功能障碍引起。心肌细胞丢失的一个常见原因是导致心肌梗死的缺血性心脏病，由于心脏再生能力有限，损伤是永久性和渐进性的。尽管在医学治疗方面取得了进展，但目前除了原位心脏移植外，还没有恢复肌肉质量的策略，而原位心脏移植受限于细胞来源数量和长期疗效。迄今为止，在人体试验中使用的细胞疗法已经证明移植的细胞不会大量变成心肌细胞，也不会在心脏中持续存在。多能干细胞来源的心肌细胞移植正在接受测试，如果在细胞存活、成熟和电生理整合等问题得到有效解决后，这可能是有价值的。利用细胞类型特异的转录因子(TF)将细胞原位重编程为在疾病中丢失的细胞类型，是一种很有希望的除细胞治疗以外的另一有效的组织再生方法。在心脏中，大量的非心肌细胞，主要是心脏成纤维细胞，可以通过转录因子转变为诱导的心肌细胞样细胞。
[0004]自第一代通过3种心脏特异性TF：GATA4、MEF2C和TBX5(GMT)的心肌细胞重编程成功问世以来，已经有很多关于增强心脏重编程效率的报道。然而，所能获得的效率仍然较低。因此，本领域仍然需要新的重编程方法，其能够通过重编程高效地产生功能性心肌细胞，从而治疗心脏疾病例如心力衰竭。
附图说明
[0005][0006]图1：分离MICF和筛选候选转录因子的策略的示意图。
[0007]图2：由ACF和NCF诱导的iCM的免疫荧光表征。报道的组合“GMT”能够从新生和成年心脏成纤维细胞诱导大量的Cherry+表达cTnI的iCMs。比例尺：100μm。
[0008]图3：A：由GMT加上其他因子诱导的mCherry+细胞第14天的定量数据(n＝3)。B： Myocd或Sall4可以增加Myh6
‑
mCherry阳性细胞的数量。诱导后两周拍照。
[0009]图4：示出GMT加Myocd和Sall4诱导后，FACS分析Myh6
‑
mCherry表达(n＝4)的结果。GMT加Myocd和Sall4诱导后，mCherry+细胞的百分比显著增加。
[0010]图5：示出GMTMS+1策略诱导的mCherry+细胞第28天的定量数据(n＝3)。
[0011]图6：示出GMTMS
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1策略诱导的细胞的统计和形态学分析结果。
[0012]图7：使用GMTMS从成肌纤维细胞生成的心肌样细胞的免疫荧光表征。(左)大量 GMTMS诱导的iCM共表达cTnT和cTnI。在用GMT、GMTM、GMTS、GMTMS(GATA4、MEF2C、TBX5、Sall4、MYOCD)和GMTMM(GATA4、MEF2C、TBX5、MESP1、MYOCD) 转导MICF(来自8周龄的C57小鼠)后3周，对cTnT(红色)和cTnI(绿色)进行了免疫荧光。(右)cTnT和cTnI双阳性细胞定量。
来自三个独立测定的数据，表示为平均值
±
SD， n＝3。比例尺：100μm.
[0013]图8：从成年心脏成纤维细胞诱导的心肌样细胞的免疫荧光表征。(左)在使用GMT、 GMTM、GMTS、GMTMS和GMTMM转导ACF(来自C57小鼠，8周大)后3周进行了 cTnT(红色)和cTnI(绿色)的免疫荧光检测。注，ACF能够通过四个转录因子进行重新编程生成大量的iCM。(右)cTnT和cTnI双阳性细胞的定量。来自三个独立实验的数据表示为平均值
±
SD，n＝3。比例尺：100μm。
[0014]图9:示出与MICF相比，GMTMS诱导的心肌细胞中心脏基因的mRNA表达高度上调。诱导4周后进行定量PCR。
[0015]图10:示出与MICF相比，GMTMS诱导的心肌细胞中成纤维细胞基因的mRNA表达下调。诱导后4周进行定量PCR。
[0016]图11:GMTMS诱导的iCM被转录重编程，使其朝向心肌细胞的命运。(A)GMTMM 和GMTMS在MICF重编程方面的全基因组比较。用KPKM对基因谱进行归一化，然后对多个样品进行分位数归一化。3个样本中变异超过1个的基因用于以下层次聚类。 (B)MICF和GMTMS中基因表达的散点图(归一化为log 2(FPKM+1))。灰点，所有基因；红点，心肌细胞特异性基因；蓝点，成纤维细胞相关基因。(C)GMTMS上调基因的前 500名的GO类别分析。仅显示典型的与心肌细胞相关的GO类别。

技术实现思路

[0017][0018]本专利技术人令人惊奇地发现，转录因子Myocd和/或Sall4可以显著促进转录因子组合 GATA4、MEF2C和TBX5(GMT)介导的心肌细胞重编程。
[0019]因此，在一方面，本专利技术提供一种将起始细胞重编程为心肌细胞的方法，所述方法包括向起始细胞提供以下的转录因子：
[0020]i)GATA4、MEF2C和TBX5；和
[0021]ii)Myocd和/或Sall4。
[0022]在一些实施方案，所述方法包括向所述起始细胞提供以下转录因子：GATA4、 MEF2C、TBX5、Myocd和Sall4。
[0023]所述转录因子可以通过本领域已知的任何方法提供给所述起始细胞，即导入所述起始细胞。例如，可以将包含编码所述转录因子的核苷酸序列的表达载体导入所述起始细胞。
[0024]所述转录因子可以是来自于哺乳动物例如小鼠或人的转录因子。所述转录因子的核苷酸序列和氨基酸序列是本领域公知的。
[0025]将表达载体导入细胞的方法是本领域已知的，包括但不限于DEAE
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葡聚糖法、磷酸钙法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物、Biolistic颗粒传递法(基因枪粒子轰击法)、显微注射法、电穿孔法和病毒介导法。
[0026]本专利技术各个方面中所述表达载体可以是本领域已知的任何表达载体。优选地，本专利技术各个方面中所述表达载体是病毒表达载体，其可以通过病毒转染实现编码所述转录因子的核苷酸序列的导入。所述病毒载体优选为慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体等。构建包含所需核苷酸序列的病毒载体例如慢病毒载体的方法是本领域已知的。
[0027]在一些实施方案中，本专利技术所述的向起始细胞提供转录因子还涵盖增加起始细胞中内源的所述转录因子的表达和/或活性。例如，可以通过修饰编码所述内源转录因子的调控区来增加所述转录因子在起始细胞中的表达。
[0028]在一些实施方案中，所述起始细胞为分化的细胞。在一些实施方案中，起始细胞是非心肌细胞。起始细胞可以为中胚层来源细胞诸如心脏细胞，外胚层来源细胞诸如神经细胞，或者内胚层来源细胞如结肠细胞。在一些实施方案中，所述起始细胞为神经元细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、间质细胞、平滑肌细胞、心肌细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种将起始细胞重编程为心肌细胞的方法，所述方法包括向起始细胞提供以下的转录因子：i)GATA4、MEF2C和TBX5；和ii)Myocd和/或Sall4。2.权利要求1的方法，其中所述方法包括向所述起始细胞提供以下转录因子：GATA4、MEF2C、TBX5、Myocd和Sall4。3.权利要求1或2的方法，其中所述方法包括将包含编码所述转录因子的核苷酸序列的表达载体导入所述起始细胞。4.权利要求3的方法，其中所述表达载体是病毒表达载体，优选为慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体。5.权利要求1或2的方法，其中所述提供转录因子包括增加起始细胞中内源的所述转录因子的表达和/或活性。6.权利要求1
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5中任一项的方法，其中所述起始细胞是成纤维细胞，例如所述成纤维细胞选自胚胎成纤维细胞、新生儿心脏成纤维细胞、尾尖成纤维细胞、成年心脏成纤维细胞和来自心脏心梗区的成纤维细胞。7.权利要求1
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6中任一项的方法，其中所述起始细胞是分离的细胞。8.权利要求1
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7中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵扬，赵宏，
申请(专利权)人：南京景瑞康分子医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：