应用人工MHC呈递特异性癌症新抗原的工程化红细胞制造技术

本发明专利技术提供用于产生红细胞或工程化红细胞的方法，更具体地，提供具有人工MHC分子的工程化红细胞(eRBCs)。这些方法将使eRBCs成为一种新型的抗原呈递细胞，用于调节癌症或免疫疾病中的免疫反应。病中的免疫反应。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】应用人工MHC呈递特异性癌症新抗原的工程化红细胞


[0001]本公开涉及用于产生红细胞或工程化红细胞的方法，更具体地，涉及具有人工MHC分子的工程化红细胞。

技术介绍

[0002]人体中有效的抗肿瘤免疫已经与针对癌症新抗原的T细胞的存在相关联，这是一类由肿瘤特异性突变引起的HLA结合型肽，并且新近的数据表明，对此类新抗原的识别是影响临床免疫治疗的活性的主要因素。大规模平行全外显子组测序已用于检测肿瘤中的所有突变以预测新抗原。应用新抗原的疫苗接种可以扩大预先存在的新抗原特异性T细胞群并诱导新的癌症特异性T细胞。尽管新抗原已成为抗肿瘤免疫反应的潜在理想靶点，但在临床应用之前仍有许多问题有待回答。
[0003]T细胞活化需要MHC分子将MHC限制性肽呈递给特定的T细胞受体。缺乏特异性抗原呈递系统是新抗原疫苗接种的问题之一。
[0004]红细胞(RBCs)是血液中最丰富的细胞类型，占人体细胞总数的四分之一。红细胞具有许多独特的特性，使其成为体内递送天然和合成载荷物质(payload)的有吸引力的工具：循环范围广(红细胞穿行身体的整个血液循环系统)；良好的生物相容性；长循环半衰期(在人体中的寿命约为120天)；较大的表面积与体积比；无细胞核和线粒体(没有蛋白质合成，增殖，突变的能力)。
[0005]工程化红细胞(eRBCs)是将新的治疗剂、免疫调节剂和诊断成像探针引入人体的有吸引力的载体。人红细胞可以从造血干细胞培养产生，但造血干细胞的来源限制了临床应用。
[0006]专利技术概述
[0007]在一个方面，本公开提供了一种生产红细胞(RBC)的方法，其包括：
[0008]1)从血液样本中收集谱系阴性和CD34阴性细胞(lin
‑
CD34
‑
细胞)，
[0009]2)扩增该lin
‑
CD34
‑
细胞；和
[0010]3)诱导扩增的lin
‑
CD34
‑
细胞分化为成熟红细胞。
[0011]在一些实施方案中，血液样本是外周血样本、脐带血样本或胎儿血液样本。
[0012]在一些实施方案中，血液样本是人外周血样本。
[0013]在一些实施方案中，步骤1)包括从外周血样本中分离外周血单个核细胞(PBMC)和从PBMC中分离lin
‑
CD34
‑
细胞。
[0014]在一些实施方案中，步骤1)包括通过使用谱系细胞去除试剂盒，从血液样本中去除谱系阳性(lin
+
)细胞。
[0015]在一些实施方案中，步骤2)包括在补充有细胞因子组合的造血干细胞扩增培养基中培养lin
‑
CD34
‑
细胞，其中所述细胞因子组合包括fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)、干细胞因子(SCF)、白介素3(IL
‑
3)和白介素6(IL
‑
6)。
[0016]在一些实施方案中，细胞因子组合包含50ng/mL人Flt3L、50ng/mL人SCF、10ng/mL
人IL
‑
3和10ng/mL人IL
‑
6。
[0017]在一些实施方案中，造血干细胞扩增培养基是StemSpan
TM SFEM无血清扩增培养基。
[0018]在一些实施方案中，步骤2)包括在37℃、5％CO2下培养lin
‑
CD34
‑
细胞约2
‑
5天。
[0019]在一些实施方案中，步骤3)包括：
[0020]i)培养扩增的lin
‑
CD34
‑
细胞以诱导其分化成红系细胞(erythroid cells)；和
[0021]ii)培养该红系细胞以诱导去核。
[0022]在一些实施方案中，步骤i)包括在补充有与红系发育相关的细胞因子的第一分化培养基中培养扩增的lin
‑
CD34
‑
细胞。
[0023]在一些实施方案中，与红系发育相关的细胞因子包括IL
‑
3和SCF。
[0024]在一些实施方案中，第一分化培养基是含有胎牛血清(FBS)、人血浆、谷氨酰胺、BSA、转铁蛋白、胰岛素、青霉素
‑
链霉素、IL
‑
3、EPO和SCF的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)。
[0025]在一些实施方案中，第一分化培养基是含有10
‑
15％FBS、5
‑
10％人血浆、1
‑
4mM谷氨酰胺、1
‑
2％BSA、300
‑
600μg/mL人转铁蛋白、8
‑
13μg/mL人胰岛素、2％青霉素
‑
链霉素、3
‑
5ng/mL人IL
‑
3、4
‑
7U/mL人EPO和100ng/mL人SCF的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)。
[0026]在一些实施方案中，步骤i)包括在37℃、5％CO2下培养扩增的lin
‑
CD34
‑
细胞约9天。
[0027]在一些实施方案中，步骤ii)包括在第二分化培养基中培养红系细胞，其中所述第二分化培养基与第一分化培养基相比缺少与红系发育相关的细胞因子。
[0028]在一些实施方案中，第二分化培养基是含有FBS、人血浆、谷氨酰胺、BSA、转铁蛋白、胰岛素、青霉素
‑
链霉素和EPO的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)。
[0029]在一些实施方案中，第二分化培养基是含有15％FBS、5
‑
10％人血浆、1
‑
4mM谷氨酰胺、1
‑
2％BSA、300
‑
600μg/mL人转铁蛋白、8
‑
13μg/mL人胰岛素、2％青霉素
‑
链霉素和1
‑
5U/mL人EPO的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)。
[0030]在一些实施方案中，步骤ii)包括在37℃、5％CO2下培养红系细胞约7天。
[0031]在另一方面，本公开提供通过上述方法产生的红细胞。
[0032]在另一方面，本公开提供用于产生工程化红细胞(eRBCs)的方法，其包括：
[0033]1)从血液样本或骨髓样本中收集谱系阴性细胞(lin
‑
细胞)；
[0034]2)扩增该lin
‑
细胞；
[0035]3)培养扩增的lin
‑
细胞以诱导其分化成红系细胞；并在分化之前或同时，将外源核酸引入该扩增的lin
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生工程化红细胞(eRBCs)的方法，包括：1)从血液样本或骨髓样本中收集谱系阴性细胞(lin
‑
细胞)，2)扩增该lin
‑
细胞；3)培养扩增的lin
‑
细胞以诱导其分化为红系细胞；并且，在分化之前或同时，将外源核酸引入扩增的lin
‑
细胞；和4)培养该红系细胞以诱导去核。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述血液样本是外周血样本、脐带血样本或胎儿血样本。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述血液样本是人外周血样本。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中，所述lin
‑
细胞是lin
‑
CD34
‑
细胞。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中，步骤1)包括从外周血样本中分离PBMCs以及从PBMCs中分离lin
‑
CD34
‑
细胞。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其中，步骤1)包括使用谱系细胞去除试剂盒，从所述外周血样本中去除谱系阳性(lin
+
)细胞。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中，步骤2)包括在补充有细胞因子组合的造血干细胞扩增培养基中培养所述lin
‑
细胞，其中所述细胞因子组合包括Flt3L、SCF、IL
‑
3和IL
‑
6。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，其中，所述造血干细胞扩增培养基是StemSpan
TM SFEM无血清扩增培养基。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的方法，其中，步骤2)包括在37℃、5％CO2下培养所述lin
‑
细胞约2
‑
5天。10.根据权利要求1
‑
9中任一项所述的方法，其中，步骤3)包括在补充有与红系发育相关的细胞因子的第一分化培养基中培养扩增的lin
‑
细胞。11.根据权利要求1
‑
10中任一项所述的方法，其中，所述与红系发育相关的细胞因子包括IL
‑
3和SCF。12.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的方法，其中，所述第一分化培养基是含有FBS、人血浆、谷氨酰胺、BSA、转铁蛋白、胰岛素、青霉素
‑
链霉素、IL
‑
3、EPO和SCF的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)。13.根据权利要求1
‑
12中任一项所述的方法，其中，所述第一分化培养基是含有10
‑
15％FBS、5
‑
10％人血浆、1
‑
4mM谷氨酰胺、1
‑
2％BSA、300
‑
600μg/mL人转铁蛋白、8
‑
13μg/mL人胰岛素、2％青霉素
‑
链霉素、3
‑
5ng/mL人IL
‑
3、4
‑
7U/mL人EPO和100ng/mL人SCF的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)。14.根据权利要求1
‑
13中任一项所述的方法，其中，步骤3)包括在37℃、5％CO2下培养扩增的lin
‑
细胞约9天。15.根据权利要求1
‑
14中任一项所述的方法，其中，步骤4)包括在第二分化培养基中培养所述红系细胞，其中所述第二分化培养基与所述第一分化培养基相比缺少与红系发育相关的细胞因子。16.根据权利要求1
‑
15中任一项所述的方法，其中，所述第二分化培养基是含有FBS、人血浆、谷氨酰胺、BSA、转铁蛋白、胰岛素、青霉素
‑
链...

【专利技术属性】
技术研发人员：高晓飞，黄彦杰，聂小千，赵雨佳，
申请(专利权)人：西湖生物医药科技杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：