修饰的红细胞及其用于递送药剂的用途制造技术

本发明专利技术提供具有与其连接的药剂的红细胞(RBC)，其中所述药剂通过分选酶介导的反应，优选通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的红细胞及其用于递送药剂的用途


[0001]本专利技术一般涉及修饰的红细胞(RBC)，并且更具体地涉及共价修饰的RBC及其用于递送药物和探针的用途。

技术介绍

[0002]用于在多种人类疾病治疗中延长药物存留时间的药物递送系统的最新发展引起了广泛关注。然而，许多系统仍然面临各种挑战和局限，例如稳定性差、不需要的毒性和免疫反应[1]。红细胞(RBC)是人体中最常见的细胞类型，由于其独特的生物学特性，已作为理想的体内药物递送系统被广泛研究了30多年，所述特性包括：(i)广泛的体内循环范围；(ii)作为生物材料具有良好的生物相容性，具有较长的体内存活时间；(iii)大的表面积体积比；(iv)没有细胞核、线粒体和其他细胞器。
[0003]通过直接包载、非共价连接外源肽，或通过使蛋白质与RBC表面蛋白特异性抗体融合来安装蛋白质，RBC已被开发为药物递送载体。已经证明，这种修饰的红细胞在体内应用方面存在局限性。例如，包封会破坏细胞膜，从而影响工程化细胞的体内存活。此外，聚合物颗粒与红细胞的非共价连接很容易解离，有效载荷将在体内很快降解。
[0004]细菌分选酶是能够以共价和位点特异性方式修饰蛋白质的转肽酶[2]。来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的野生型分选酶A(wtSrtA)识别LPXTG基序并在苏氨酸和甘氨酸之间切割以在酶和底物蛋白之间形成共价酰基
‑
酶中间体。该中间体通过肽或蛋白质的亲核攻击而解体，其中所述肽或蛋白质通常在N端具有三个连续的甘氨酸残基(3<br/>×
甘氨酸，G3)。以前的研究已经在RBC上遗传过表达C端具有LPXTG基序的膜蛋白KELL，它可以通过使用wtSrtA连接到3
×
甘氨酸或G
(n≥3)
修饰的蛋白质/肽的N端[3]。这些携带药物的RBC已在动物模型上显示出治疗疾病的功效。然而，这需要对造血干细胞或祖细胞(HSPCs)进行工程改造以及将这些细胞分化为成熟RBC的步骤，这极大地限制了其应用。
[0005]因此，本领域仍然需要改进的RBC递送系统。
[0006]专利技术概述
[0007]在一个一般方面，本专利技术提供了一种红细胞(RBC)，其具有与其连接的药剂，其中该药剂通过分选酶介导的反应，且优选地通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε
‑
氨基缀合，与RBC的至少一种内源性非工程化膜蛋白连接。在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε
‑
氨基缀合至少发生在位于所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点的甘氨酸
(n)
和/或赖氨酸ε
‑
氨基基团上，优选地n为1或2。
[0008]在一些实施方案中，RBC未经过基因工程改造以表达包含分选酶识别基序或亲核受体序列的蛋白质，并且优选地RBC是天然RBC，例如天然人RBC。
[0009]在一些实施方案中，分选酶能够介导甘氨酸
(n)
缀合和/或赖氨酸侧链ε
‑
氨基基团缀合，优选缀合在所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点，优选n为1或2。
[0010]在一些实施方案中，分选酶是分选酶A(SrtA)，例如金黄色葡萄球菌转肽酶A变体(mgSrtA)。例如，mgSrtA包含与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成。
[0011]在一些实施方案中，药剂在与RBC连接之前，在其C
‑
末端包含分选酶识别基序。
[0012]在一些实施方案中，分选酶识别基序包含或基本上由或由选自以下的氨基酸序列组成：LPXTG、LPXAG、LPXSG、LPXLG、LPXVG、LGXTG、LAXTG、LSXTG、NPXTG、MPXTG、IPXTG、SPXTG、VPXTG、YPXRG、LPXTS和LPXTA，其中X是任何氨基酸。
[0013]在一些实施方案中，所述药剂包括结合剂、治疗剂或检测剂，包括例如蛋白质、肽如寡聚血管紧张素转换酶2(ACE2)的胞外结构域、抗体或其功能性抗体片段、抗原或表位例如肿瘤抗原、MHC
‑
肽复合物、药物如小分子药物(例如抗肿瘤剂，例如化疗剂)、酶(例如功能性代谢酶或治疗性酶)、激素、细胞因子、生长因子、抗微生物剂、探针、配体、受体、免疫耐受诱导肽、靶向部分、前药或其任何组合。
[0014]在一些实施方案中，与药剂连接的RBC表面上的至少一种内源性非工程化膜蛋白包含A1‑
LPXT
‑
P1结构，其中LPXT与P1中的甘氨酸
(n)
连接；和/或包含A1‑
LPXT
‑
P2结构，其中LPXT与P2中的赖氨酸侧链ε
‑
氨基连接，其中n优选为1或2，A1表示药剂，P1和P2独立地表示所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域，X表示任何氨基酸。
[0015]在另一个方面，本专利技术提供了一种红细胞(RBC)，其具有与RBC表面上的至少一种内源性、非工程化膜蛋白连接的药剂，其中与药剂连接的所述至少一种内源性非工程化膜蛋白包含A1‑
LPXT
‑
P1结构，其中LPXT与P1中的甘氨酸
(n)
连接；和/或包含A1‑
LPXT
‑
P2结构，其中LPXT与P2中的赖氨酸侧链ε
‑
氨基连接，其中n优选为1或2，A1表示药剂，P1和P2独立地表示所述至少一种内源性非工程化膜蛋白，X表示任何氨基酸。在一些实施方案中，所述连接至少发生在位于所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点的甘氨酸
(n)
和/或赖氨酸ε
‑
氨基基团上，优选n为1或2。
[0016]在另一个一般方面，本专利技术提供了一种用于共价修饰红细胞(RBC)的至少一种内源性非工程化膜蛋白的方法，所述方法包括：在分选酶存在下，使RBC与包含分选酶识别基序和药剂的分选酶底物接触，其中所述接触在适于所述分选酶将分选酶底物缀合到红细胞的所述至少一种内源性非工程化膜蛋白上的条件下进行，其中所述缀合通过分选酶介导的反应，优选地通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε
‑
氨基基团缀合而实现。在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε
‑
氨基缀合至少发生在位于所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点的甘氨酸
(n)
和/或赖氨酸ε
‑
氨基基团上，优选n为1或2。
[0017]在一些实施方案中，RBC未经过基因工程改造以表达包含分选酶识别基序或亲核受体序列的蛋白质，并且优选地RBC是天然RBC，例如天然人RBC。
[0018]在一些实施方案中，分选酶能够介导本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种红细胞(RBC)，其具有与其连接的药剂，其中该药剂通过分选酶介导的反应，且优选地通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε
‑
氨基基团缀合，与所述RBC的至少一种内源性非工程化膜蛋白连接。2.根据权利要求1所述的红细胞，其中所述分选酶介导的甘氨酸缀合和/或所述分选酶介导的赖氨酸侧链ε
‑
氨基缀合至少发生在位于所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点的甘氨酸
(n)
和/或赖氨酸ε
‑
氨基基团上，优选地n为1或2。3.根据权利要求1或2所述的红细胞，其中所述RBC未经过基因工程改造以表达包含分选酶识别基序或亲核受体序列的蛋白质，并且优选地所述RBC是天然RBC，例如天然人RBC。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的红细胞，其中所述分选酶能够介导甘氨酸
(n)
缀合和/或赖氨酸侧链ε
‑
氨基基团缀合，优选缀合在所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点，优选n为1或2。5.根据权利要求4所述的红细胞，其中所述分选酶是分选酶A(SrtA)，例如金黄色葡萄球菌转肽酶A变体(mgSrtA)。6.根据权利要求5所述的红细胞，其中所述mgSrtA包含与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的红细胞，其中所述药剂在与RBC连接之前，在其C
‑
末端包含分选酶识别基序。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的红细胞，其中所述分选酶识别基序包含或基本上由或由选自以下的氨基酸序列组成：LPXTG、LPXAG、LPXSG、LPXLG、LPXVG、LGXTG、LAXTG、LSXTG、NPXTG、MPXTG、IPXTG、SPXTG、VPXTG、YPXRG、LPXTS和LPXTA，其中X是任何氨基酸。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的红细胞，其中所述所述药剂包括结合剂、治疗剂或检测剂，包括例如蛋白质、肽如寡聚ACE2的胞外结构域、抗体或其功能性抗体片段、抗原或表位例如肿瘤抗原、MHC
‑
肽复合物、药物如小分子药物(例如抗肿瘤剂，例如化疗剂)、酶(例如功能性代谢酶或治疗性酶)、激素、细胞因子、生长因子、抗微生物剂、探针、配体、受体、免疫耐受诱导肽、靶向部分、前药或其任何组合。10.根据权利要求1
‑
9中任一项所述的红细胞，其中与药剂连接的RBC表面上的至少一种内源性非工程化膜蛋白包含A1‑
LPXT
‑
P1结构，其中LPXT与P1中的甘氨酸
(n)
连接；和/或包含A1‑
LPXT
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P2结构，其中LPXT与P2中的赖氨酸侧链ε
‑
氨基连接，其中n优选为1或2，A1表示药剂，P1和P2独立地表示所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域，X表示任何氨基酸。11.一种红细胞(RBC)，其具有与RBC表面上的至少一种内源性、非工程化膜蛋白连接的药剂，其中与药剂连接的所述至少一种内源性非工程化膜蛋白包含A1‑
LPXT
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P1结构，其中LPXT与P1中的甘氨酸
(n)
连接；和/或包含A1‑
LPXT
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P2结构，其中LPXT与P2中的赖氨酸侧链ε
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氨基连接，其中n优选为1或2，A1表示药剂，P1和P2独立地表示所述至少一种内源性非工程化膜蛋白，X表示任何氨基酸。12.根据权利要求11所述的红细胞，其中所述连接至少发生在位于所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点的甘氨酸
(n)
和/或赖氨酸ε
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氨基基团上，优选n为1或2。13.一种用于共价修饰红细胞(RBC)的至少一种内源性非工程化膜蛋白的方法，所述方
法包括：在分选酶存在下，使RBC与包含分选酶识别基序和药剂的分选酶底物接触，其中所述接触在适于所述分选酶将分选酶底物缀合到红细胞的所述至少一种内源性非工程化膜蛋白上的条件下进行，其中所述缀合通过分选酶介导的反应，优选地通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε
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氨基基团缀合而实现。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε
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氨基缀合至少发生在位于所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点的甘氨酸
(n)
和/或赖氨酸ε
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氨基基团上，优选n为1或2。15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述RBC未经过基因工程改造以表达包含分选酶识别基序或亲核受体序列的蛋白质，并且优选地所述RBC是天然RBC，例如天然人RBC。16.根据权利要求13
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15中任一项所述的方法，其中所述分选酶能够介导甘氨酸
(n)
缀合和/或赖氨酸侧链ε
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氨基缀合，优选地缀合在所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点，优选n为1或2。17.权利要求16的方法，其中分选酶是分选酶A(SrtA)，例如金黄色葡萄球菌转肽酶A变体(mgSrtA)。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述mgSrtA包含或基本上由或由与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸序列组成。19.根据权利要求13
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18中任一项所述的方法，其中所述分选酶底物在其C末端包含分选酶识别基序。20.根据权利要求13
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19中任一项所述的方法，其中所述分选酶识别基序包含或基本上由或由选自以下的氨基酸序列组成：LPXTG、LPXAG、LPXSG、LPXLG、LPXVG、LGXTG、LAXTG、LSXTG、NPXTG、MPXTG、IPXTG、SPXTG、VPXTG、YPXRG、LPXTS和LPXTA，其中X是任何氨基酸。21.根据权利要求13
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20中任一项所述的方法，其中所述药剂包括结合剂、治疗剂或检测剂，包括例如蛋白质、肽如寡聚ACE2的胞外结构域、抗体或其功能性抗体片段、抗原或表位例如肿瘤抗原、MHC
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肽复合物、药物例如小分子药物(例如抗肿瘤剂，例如化疗剂)、酶(例如功能性代谢酶或治疗性酶)、激素、细胞因子、生长因子、抗微生物剂、探针、配体、受体、免疫耐受诱导肽、靶向部分、前药或其任何组合。22.根据权利要求13
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21中任一项所述的方法，其中所述RBC表面上共价修饰的所述至少一种内源性非工程化膜蛋白包含A1‑
LPXT
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【专利技术属性】
技术研发人员：高晓飞，黄彦杰，董佳，聂小千，
申请(专利权)人：西湖生物医药科技杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：