工程化红细胞用于治疗痛风和高尿酸血症制造技术

本发明专利技术提供包含尿酸氧化酶(UOX)或其功能变体；尿酸转运蛋白1(URAT1)或其功能变体；或UOX或其功能变体和URAT1或其功能变体的工程化红细胞。本发明专利技术也提供所述工程化红细胞在治疗高尿酸血症相关疾病中的应用。疗高尿酸血症相关疾病中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程化红细胞用于治疗痛风和高尿酸血症
专利

[0001]本公开涉及工程化红细胞，并且具体地涉及工程化改造以携带URAT1和/或UOX的红细胞。本公开还涉及用于治疗高尿酸血症相关疾病的方法。

技术介绍

[0002]痛风是成人，尤其是成年男性中最常见的炎症性关节炎，全球流行率为1％至4％[1,2]。当单钠尿酸盐晶体(MSU)沉积在组织中时，会引起炎症和痛风发作的剧烈疼痛。痛风的生物学前兆是血清尿酸(UA)水平升高(即，高尿酸血症)。尽管高尿酸血症是痛风发展的最强单一危险因素，并且普遍存在于痛风患者中，但并非所有高尿酸血症患者都会发展为痛风。最近的工作强调了先天免疫反应的重要性[2]。
[0003]常规的降尿酸药物，如抗炎药(秋水仙碱)、黄嘌呤氧化酶抑制剂(别嘌醇、非布索坦)或促尿酸排泄药物(丙磺舒、苯溴马隆)，诱导非常缓慢的尿酸沉积物的减少，痛风患者的痛风石无法快速消退，故此疗法只能用于疾病早期的治疗[3]。
[0004]尿酸氧化酶(UOX,尿酸酶)是一种肝脏酶，可将尿酸盐代谢为尿囊素(allantoin)，这是一种水溶性更强的化合物，很容易被肾脏排泄[2,3]。除人类和某些灵长类动物外，所有其他哺乳动物都会产生UOX。事实上，在进化过程中，UOX在人类中的失活主要是由于编码这种酶的基因中的错义和移码突变[2,4]。当不能使用常规的降尿酸药物时，尿酸酶无疑是慢性痛风石性痛风的一种有价值的治疗选择。
[0005]拉布立酶(Rasburicase)是一种重组黄曲霉(A.flavus)UOX，于2001年被EMEA批准并于2002年被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于肿瘤溶解综合征[5,6]。该药物显著降低血清尿酸盐水平，并且比别嘌醇作用更快。儿童和成人的推荐剂量为0.2mg/kg[7,8]。但其生物学半衰期短——仅21h，因此拉布立酶每天输注一次，持续≤7天[7]。此外，最近的研究表明，重复注射UOX会引起过敏性反应，产生中和UOX酶活性的抗体[9]。
[0006]Pegloticase，是一种改良的聚乙二醇化的重组猪狒蛋白UOX，被开发为第一个用于治疗难治性痛风的高尿酸血症的非免疫原性生物制剂，已被FDA批准用于慢性痛风患者[3,10]。一项相对于安慰剂的为期6个月的研究表明，pegloticase(每2周输注8mg)导致约40％患者的血浆显著降低(伴有痛风石溶解趋势)[3]。然而，大部分患者无反应，这与中和UOX的抗体的形成与输注反应有关[3]。超过10％的受试者出现了肾结石、关节痛、贫血、肌肉痉挛、呼吸困难、头痛、恶心和发烧等不良事件[7]。
[0007]重组UOX(rasburicase，pegloticase)药物是有效降尿酸药剂。然而，目前的疗法存在一些局限性。首先，UOX具有显著的免疫原性，会引起严重的过敏反应[11]。将治疗性酶与PEG缀合可降低患者的免疫反应。然而，研究表明，许多用PEG缀合酶治疗的患者还会产生抗PEG抗体，特别是在重复和连续治疗时，PEG会影响酶活性及药效[12,13]。其次，由于半衰期短、生物利用度有限和/或与血浆蛋白的相互作用，这些治疗性酶可能在体内失活或被清除[14]。第三，酶的生产和纯化往往很耗时，因此酶替代疗法的治疗成本非常高。
rasburicase的治疗费用(按年计算)估计约为7200欧元，pegloticase为41,240欧元[3]。因此，我们需要更有效、更安全的新痛风疗法。
[0008]工程化红细胞(erRBC)是引入新治疗剂的有吸引力的载体，具有以下优点：(1)红细胞是血液中最丰富的细胞，占人体细胞的四分之一，通过循环广泛分布于人体；(2)红细胞寿命长(人：约120天，小鼠：约50天)。此外，衰老或受损的红细胞可以在肝脏和脾脏中由巨噬细胞清除，此过程中不引起免疫反应；(3)红细胞具有良好的生物相容性，尤其是在使用自体红细胞的情况下；(4)成熟的红细胞没有细胞核、线粒体等其他细胞器。因此，对红系前体细胞进行基因改造，不会导致修饰后的成熟红细胞在体内循环过程中发生畸变或产生致瘤性；(5)红细胞可以保护药物免于过早失活和/或降解、以及保护机体免受药物的毒性作用[15
‑
17]。
[0009]人体中的主要尿酸盐由肾脏排泄，由于尿酸的排泄量比肾小球的过滤量少，因此尿酸向血液中的重吸收占主导。尿酸通道蛋白(urate transporter,URAT1)是一种尿酸盐阴离子交换剂，可以从尿腔中重吸收尿酸盐[2,18]。
[0010]显著降低UOX的免疫原性、延长UOX的半衰期，快速消融痛风石，是开发新痛风疗法的关键目标。
[0011]专利技术概述
[0012]一方面，本公开提供一种工程化红细胞(eRBC)，其包含：
[0013]尿酸氧化酶(UOX)或其功能变体；
[0014]尿酸转运蛋白1(URAT1)或其功能变体；或者
[0015]UOX或其功能变体和URAT1或其功能变体。
[0016]在一些实施方案中，URAT1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
[0017]在一些实施方案中，UOX包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
[0018]另一方面，本公开提供一种生产工程化红细胞的方法，包括：
[0019]1)从血液样本中收集谱系阴性细胞(Lin
‑
细胞)或从骨髓样本中收集Lin
‑
CD34
+
细胞，
[0020]2)扩增Lin
‑
或Lin
‑
CD34
+
细胞；
[0021]3)培养扩增的Lin
‑
或Lin
‑
CD34
+
细胞以诱导其分化成红系细胞(erythroid cells)；并且，在分化的同时，将一种或多种外源核酸引入扩增的Lin
‑
细胞或Lin
‑
CD34
+
细胞；
[0022]4)培养红系细胞以诱导去核，
[0023]其中所述一种或多种外源核酸包含编码尿酸氧化酶(UOX)或其功能变体的第一多核苷酸序列、编码尿酸转运蛋白1(URAT1)或其功能变体的第二多核苷酸序列；或第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列两者。
[0024]在一些实施方案中，URAT1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
[0025]在一些实施方案中，UOX包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
[0026]在一些实施方案中，血液样本是外周血样本、脐带血样本或胎儿血样本。
[0027]在一些实施方案中，血液样本是人外周血样本。
[0028]在一些实施方案中，Lin
‑
细胞是Lin
‑
CD34
‑
细胞。
[0029]在一些实施方案中，步骤1)包括从外周血样本中分离外周血单个核细胞(PBMC)和
从PBMC中分离Lin<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种工程化红细胞(eRBC)，其包含：尿酸氧化酶(UOX)或其功能变体；尿酸转运蛋白1(URAT1)或其功能变体；或UOX或其功能变体和URAT1或其功能变体。2.根据权利要求1所述的工程化红细胞，其中所述URAT1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的工程化红细胞，其中所述UOX包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。4.一种生产工程化红细胞的方法，包括：1)从血液样本中收集谱系阴性细胞(Lin
‑
细胞)或从骨髓样本中收集Lin
‑
CD34
+
细胞，2)扩增该Lin
‑
细胞或Lin
‑
CD34
+
细胞；3)培养该扩增的Lin
‑
细胞或Lin
‑
CD34
+
细胞以诱导其分化为红系细胞；并且，在分化同时，将一种或多种外源核酸引入扩增的Lin
‑
细胞或Lin
‑
CD34
+
细胞；和4)培养该红系细胞以诱导去核，其中所述一种或多种外源核酸包含编码尿酸氧化酶(UOX)或其功能变体的第一多核苷酸序列、编码尿酸转运蛋白1(URAT1)的第二多核苷酸序列或其功能变体；或第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列两者。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述URAT1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述UOX包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。7.根据权利要求4
‑
6中任一项所述的方法，其中，所述血液样本是外周血样本、脐带血样本或胎儿血样本。8.根据权利要求4
‑
7中任一项所述的方法，其中，所述血液样本是人外周血样本。9.根据权利要求4
‑
8中任一项所述的方法，其中，所述Lin
‑
细胞是Lin
‑
CD34
‑
细胞。10.根据权利要求4
‑
9中任一项所述的方法，其中，步骤1)包括从外周血样本中分离外周血单个核细胞(PBMC)和从所述PBMC中分离Lin
‑
CD34
‑
细胞。11.根据权利要求4
‑
10中任一项所述的方法，其中，步骤1)包括通过使用谱系细胞去除试剂盒，从所述外周血样本中去除谱系阳性(Lin
+
)细胞。12.根据权利要求4
‑
11中任一项所述的方法，其中，步骤2)包括在补充有细胞因子组合的造血干细胞扩增培养基中培养所述Lin
‑
细胞，其中所述细胞因子组合包括fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)、干细胞因子(SCF)、白介素3(IL
‑
3)和白介素6(IL
‑
6)。13.根据权利要求4
‑
12中任一项所述的方法，其中所述细胞因子组合包括50ng/mL人Flt3L、50ng/mL人SCF、10ng/mL人IL
‑
3和10ng/mL人IL
‑
6。14.根据权利要求4
‑
13中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞扩增培养基是StemSpan
TM SFEM无血清扩增培养基。15.根据权利要求4
‑
14中任一项所述的方法，其中，步骤2)包括在37℃、5％CO2下培养Lin
‑
细胞约5天。16.根据权利要求4
‑
15中任一项所述的方法，其中，步骤3)包括在补充有与红系发育相关的细胞因子的第一分化培养基中培养扩增的Lin
‑
细胞。17.根据权利要求4
‑
16中任一项所述的方法，其中所述第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：高晓飞，聂小千，黄彦杰，李卉，
申请(专利权)人：西湖生物医药科技杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：