一种重组CHO细胞、其构建方法、利用其的检测系统和方法技术方案

提供了一种重组CHO细胞及其构建方法、包含该重组CHO细胞的检测系统以及利用该重组CHO细胞的检测方法。该重组CHO细胞在其细胞表面上稳定表达NGF，能够用作ADCC效应和CDC效应检测的靶细胞。检测的靶细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种重组CHO细胞、其构建方法、利用其的检测系统和方法


[0001]本申请属于免疫效应检测领域，具体而言，涉及一种重组CHO细胞、构建该重组CHO细胞的方法、利用该细胞检测抗体的ADCC效应和CDC效应的检测系统和检测方法。

技术介绍

[0002]ADCC(antibody
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dependent cell
‑
mediated cytotoxicity)，即抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，是指抗体通过Fab段与靶细胞表面的抗原决定簇特异性结合后，其Fc段与具有FcγR的效应细胞结合，触发效应细胞的杀伤活性，直接杀伤靶细胞。ADCC效应是机体抗感染、抗肿瘤的重要免疫机制，参与ADCC的效应细胞主要包括自然杀伤(natural killed，NK)细胞、吞噬细胞(phagocyte)、嗜酸性粒细胞(eosinophil)、嗜碱性粒细胞(basophil)和肥大细胞(mast cell)等。
[0003]CDC(complement dependent cytotoxicity)，即补体依赖的细胞毒作用，是指补体参与的细胞毒作用，即通过特异性抗体与细胞膜表面相应抗原结合，形成复合物而激活补体经典途径，首先由补体蛋白C1q起始补体经典途径，接着补体蛋白C2
‑
C9被激活形成攻膜复合物(membrane attack complex，MAC)，对靶细胞发挥裂解效应。
[0004]考虑到ADCC效应和CDC效应在肿瘤免疫中的重要作用，在目前的抗肿瘤抗体的开发中，很多研究者希望通过对抗体结构的特定设计来得到改善的ADCC效应和CDC效应。而在其它类型抗体的开发中，抗体介导的ADCC效应和CDC效应并不总是期望的。
[0005]神经生长因子(NGF)是神经营养因子中最早被发现的，产生于新皮质和海马部位，其由两个α亚基、一个β亚基和两个γ亚基构成，能促进中枢和外周神经元的生长、发育、分化、成熟，维持神经系统的正常功能，加快神经系统损伤后的修复。目前主要将重组NGF用于治疗各种神经性病变及神经损伤。
[0006]中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)是最广泛使用的哺乳动物细胞表达系统之一，其具有良好的翻译后加工能力，使表达产物能够保持天然的结构和活性。目前已经将CHO用于表达NGF并将重组的NGF分泌到细胞外，从而能够大规模生产得到NGF(例如Xu L et al.,Expression,purification,and characterization of recombinant mouse nerve growth factor in Chinese hamster ovary cells.Protein Expr Purif,2014,104:41
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49；Wang XY et al.,Characteristic element of matrix attachment region mediates vector attachment and enhances nerve growth factor expression in Chinese hamster ovary cells.Genet Mol Res,2015,14(3):9191
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9199)。然而，目前尚未报道能够稳定地在重组的CHO细胞表面上表达NGF方面的研究。

技术实现思路

[0007]为了能够准确地检测到抗NGF抗体的ADCC效应和CDC效应，专利技术人通过研究开发了一种重组CHO细胞，该细胞能够在其表面上稳定表达NGF，将其作为靶细胞可有效地用于评估抗NGF抗体的ADCC效应和CDC效应。
[0008]一方面，本申请涉及一种重组CHO细胞，其中，在所述细胞的表面上稳定表达NGF。
[0009]另一方面，本申请涉及一种构建上述的重组CHO细胞的方法，包括：
[0010](1)将串联的NGF、铰链区和跨膜区的核酸序列克隆到表达载体中，得到包含所述核酸序列的重组表达载体；
[0011](2)将所述重组表达载体导入CHO细胞中，得到重组CHO细胞。
[0012]另一方面，本申请涉及一种检测抗体的ADCC效应的系统，其中，所述系统包括：
[0013]上述的重组CHO细胞，以及
[0014]效应细胞。
[0015]另一方面，本申请涉及一种检测抗体的CDC效应的系统，其中，所述系统包括：
[0016]上述的重组CHO细胞，以及
[0017]补体。
[0018]又一方面，本申请涉及上述的重组CHO细胞在用于检测抗体的ADCC效应或CDC效应中的用途。
[0019]又一方面，本申请涉及一种检测抗体的ADCC效应的方法，其中，所述方法包括将上述的重组CHO细胞作为靶细胞与待测抗体和效应细胞共同孵育。
[0020]又一方面，本申请涉及一种检测抗体的CDC效应的方法，其中，所述方法包括将上述的重组CHO细胞作为靶细胞与待测抗体和补体共同孵育。
[0021]在常规的重组NGF表达研究中，通常将CHO细胞等哺乳动物细胞用作表达系统，以将NGF表达并分泌到细胞外，使其以与天然形态类似的游离形式存在于上清液中。另外，一些研究人员也尝试了采用原核系统(例如E.coli)来表达NGF，得到的表达产物以不溶性包含体存在(姜静等，来源于E.coli和CHO表达系统的重组人β
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NGF性质比较，《中国生物工程杂志》，2006，26(2)：8
‑
12)。NGF本身作为游离蛋白而非跨膜蛋白是否能够在细胞表面表达存在很大的不确定性。因此，对于在CHO细胞表面上稳定表达NGF，本领域迄今为止尚未有相关报道。本申请中通过将NGF的核酸序列与适当的铰链区和跨膜区的核酸序列串联后导入CHO细胞中，实现了在重组CHO细胞表面上稳定表达NGF，由此使NGF存在于细胞表面上而非分泌到培养液中，并能够使表达的NGF得以进行恰当的翻译后加工(包括正确折叠、糖基化等)而保持天然构象和活性。由此得到的重组CHO细胞在细胞表面上具有NGF而能够有效地用作检测抗NGF抗体的ADCC效应和CDC效应的靶细胞，从而可用于对抗NGF抗体的ADCC效应和CDC效应进行检测。
附图说明
[0022]图1示出了阳性对照抗体HAB20
‑6‑
2的SDS
‑
PAGE检测结果。根据图1中的结果可知，实施例3中制备的阳性对照抗体HAB20
‑6‑
2的纯度大于90％。
[0023]图2示出了CHO
‑
NGF重组细胞的流式鉴定结果。其中，图2中的A示出了通过将作为空白对照的CHO
‑
S细胞与抗NGF阳性对照抗体HAB20
‑6‑
2孵育而得到的流式检测结果，阳性率为2％；图2中的B示出了通过将实施例2构建的CHO
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NGF细胞与抗NGF阳性对照抗体HAB20
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组CHO细胞，其中，在所述细胞的表面上稳定表达NGF。2.根据权利要求1所述的重组CHO细胞，其中，所述NGF为哺乳动物NGF。3.根据权利要求1或2所述的重组CHO细胞，其中，所述NGF为人NGF、小鼠NGF、大鼠NGF、牛NGF、马NGF或猪NGF。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的重组CHO细胞，其中，所述NGF的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1
‑
SEQ ID NO:3中任一者示出的氨基酸序列或与其具有至少80％序列一致性的氨基酸序列。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的重组CHO细胞，其中，所述细胞的基因组中整合有NGF的核酸序列。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的重组CHO细胞，其中，所述NGF的核酸序列包含SEQ ID NO:4
‑
SEQ ID NO:6中任一者示出的核酸序列或与其具有至少80％序列一致性的核酸序列。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的重组CHO细胞，其中，所述细胞的基因组中整合有串联的NGF、铰链区和跨膜区的核酸序列。8.根据权利要求7所述的重组CHO细胞，其中，所述铰链区的氨基酸序列具有3
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100个氨基酸、优选12
‑
45个氨基酸。9.根据权利要求7或8所述的重组CHO细胞，其中，所述跨膜区的氨基酸序列具有10
‑
60个氨基酸、优选20
‑
25个氨基酸。10.根据权利要求7
‑
9中任一项所述的重组CHO细胞，其中，所述铰链区为CD8铰链区或人IgG1铰链区。11.根据权利要求10所述的重组CHO细胞，其中，所述CD8铰链区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:7示出的氨基酸序列或与其具有至少80％序列一致性的氨基酸序列。12.根据权利要求11所述的重组CHO细胞，其中，编码所述CD8铰链区的核酸序列包含SEQ ID NO:9示出的核酸序列或与其具有至少80％序列一致性的核酸序列。13.根据权利要求10所述的重组CHO细胞，其中，所述人IgG1铰链区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:8示出的氨基酸序列或与其具有至少80％序列一致性的氨基酸序列。14.根据权利要求7
‑
13中任一项所述的重组CHO细胞，其中，所述跨膜区为CD8跨膜区、PGFRA跨膜区或CD80跨膜区。15.根据权利要求14所述的重组CHO细胞，其中，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:10示出的氨基酸序列或与其具有至少80％序列一致性的氨基酸序列。16.根据权利要求15所述的重组CHO细胞，其中，编码所述CD8跨膜区的核酸序列包含SEQ ID NO:13示出的核酸序列或与其具有至少80％序列一致性的核酸序列。17.根据权利要求14所述的重组CHO细胞，其中，所述PGFRA跨膜区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:11示出的氨基酸序列或与其具有至少80％序列一致性的氨基酸序列。18.根据权利要求14所述的重组CHO细胞，其中，所述CD80跨膜区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:12示出的氨基酸序列或与其具有至少80％序列一致性的氨基酸序列。19.根据权利要求7
‑
18中任一项所述的重组CHO细胞，其中，所述铰链区为CD8铰链区，且所述跨膜区为CD8跨膜区、PGFRA跨膜区或CD80跨膜区。20.根据权利要求7
‑
18中任一项所述的重组CHO细胞，其中，所述铰链区为人IgG1铰链
区，且所述跨膜区为CD8跨膜区、PGFRA跨膜区或CD80跨膜区。21.根据权利要求7
‑
19中任一项所述的重组CHO细胞，其中，所述串联的NGF、铰链区和跨膜区的核酸序列为串联的NGF、CD8铰链区和CD8跨膜区的核酸序列。22.一种构建权利要求1
‑
21中任一项所述的重组CHO细胞的方法，包括：(1)将串联的NGF、铰链区和跨膜区的核酸序列克隆到表达载体中，得到包含所述核酸序列的重组表达载体；(2)将所述重组表达载体导入CHO细胞中，得到重组CHO细胞。23.如权利要求22所述的方法，其中，所述NGF为哺乳动物NGF。24.根据权利要求22或23所述的方法，其中，所述NGF为人NGF、小鼠NGF、大鼠NGF、牛NGF、马NGF或猪NGF。25.根据权利要求22
‑
24中任一项所述的方法，其中，所述NGF的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1
‑
SEQ ID NO:3中任一者示出的氨基酸序列或与其具有至少80％序列一致性的氨基酸序列。26.根据权利要求22
‑
25中任一项所述的方法，其中，所述NGF的核酸序列包含SEQ ID NO:4
‑
SEQ ID NO:6中任一者示出的核酸序列或与其具有至少80％序列一致性的核酸序列。27.根据权利要求22
‑
26中任一项所述的方法，其中，所述铰链区的氨基酸序列具有3
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100个氨基酸、优选12
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45个氨基酸。28.根据权利要求22
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27中任一项所述的方法，其中，所述跨膜区的氨基酸序列具有10
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60个氨基酸、优选20
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25个氨基酸。29.根据权利要求22
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28中任一项所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：李竹石，陈洪，王颖，
申请(专利权)人：成都优洛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：