对梭菌神经毒素高度敏感的细胞制造技术

一种制备对梭菌神经毒素高度敏感的细胞群的方法，所述方法包括：(a)使表达指示蛋白的重组细胞与梭菌神经毒素接触；和(b)在该接触之后，选择表现指示蛋白切割的细胞。来自使用上述方法产生的群的细胞。一种确定修饰的或重组的神经毒素的活性的测定法，该测定法包括使此类细胞与修饰的或重组的神经毒素在足以允许野生型梭菌神经毒素的蛋白酶结构域切割细胞中的指示蛋白的条件和时间段内接触，以及确定由指示蛋白切割产生的产物的存在。定由指示蛋白切割产生的产物的存在。定由指示蛋白切割产生的产物的存在。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对梭菌神经毒素高度敏感的细胞


[0001]本专利技术总体上涉及产生对梭菌神经毒素如肉毒杆菌神经毒素和破伤风神经毒素高度敏感的细胞群的方法。

技术介绍

[0002]厌氧革兰氏阳性菌肉毒杆菌(Clostridium botulinum)产生各种不同类型的神经毒素，包括肉毒杆菌神经毒素(BoNT)和破伤风神经毒素(TeNT)。
[0003]BoNT是已知的最有效的毒素，取决于血清型，其对小鼠的半数致死量(LD
50
)值为0.5至5ng/kg。BoNT经胃肠道吸附，进入全身循环(general circulation)后，与胆碱能神经末梢的突触前膜结合，阻止神经递质乙酰胆碱的释放。
[0004]BoNT以其引起肌肉弛缓性麻痹的能力而闻名。所述肌肉松弛的特性已使得BoNT被用于各种医疗和美容程序，包括治疗眉间线或运动过度的面部线、头痛、偏侧面肌痉挛、膀胱过度活跃、多汗、鼻唇线、颈肌张力障碍、眼睑痉挛和痉挛。
[0005]目前至少有八种不同类别的BoNT，即：BoNT血清型A、B、C、D、E、F、G和H(分别称为B本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种使细胞群进化以表现对梭菌神经毒素的敏感性的方法，所述方法包括：(a)使细胞群与所述梭菌神经毒素接触；其中所述群包含表达以下的细胞：i.可被所述梭菌神经毒素切割的指示蛋白；和ii.对所述梭菌神经毒素具有结合亲和力的受体和/或神经节苷脂(优选受体和神经节苷脂)；(b)鉴定表现出切割所述指示蛋白的细胞；(c)分离步骤b)中鉴定的细胞；和(d)对所述顺次步骤(a)
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(c)进行至少一次迭代，其中所述步骤(a)中使用的细胞群包含所述步骤(c)中分离的细胞和/或其后代细胞或由其组成；任选地，其中，在每次迭代之前，培养在前面的步骤c)中分离的细胞，直到所述细胞的数量基本上等于在前面的步骤a)中的细胞数量。2.一种制备对梭菌神经毒素高度敏感的细胞群的方法，所述方法包括：(a)使表达指示蛋白的重组细胞与所述梭菌神经毒素接触；和(b)之后，选择表现出切割所述指示蛋白的细胞。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤(a)包括在包含梭菌神经毒素的培养基中培养所述细胞。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括在包含浓度为约0.0001至约10,000pM的梭菌神经毒素的培养基中培养所述细胞。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括在包含梭菌神经毒素的培养基中培养所述细胞约2小时或更长时间。6.根据权利要求2
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5中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括确定是否发生了所述指示蛋白的切割。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述指示蛋白包含SNARE结构域。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述指示蛋白包含(i)突触融合蛋白、(ii)小突触泡蛋白、(iii)SNAP
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25、或(iv)对野生型梭菌神经毒素的蛋白酶组分的蛋白水解敏感的其变体或片段的氨基酸序列；优选包含SNAP
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25的氨基酸序列。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述指示蛋白被标记；优选地，被一种或多种荧光蛋白标记的氨基酸序列标记。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述指示蛋白包含C端标记；优选包含N端标记和C端标记；优选其中所述N端标记和C端标记是可区分的。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述指示蛋白包含(i)SNAP
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25或其变体或片段、(ii)N端标记和(iii)C端标记的氨基酸序列。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述指示蛋白用mScarlet的氨基酸序列和NeonGreen的氨基酸序列标记。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述指示蛋白用mScarlet的氨基酸序列作为N端标记和NeonGreen作为C端标记进行标记。14.根据权利要求10
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13中任一项所述的方法，其中通过测量来自所述C端标记的信号来测定所述指示蛋白的切割；优选地，其中在与所述梭菌神经毒素接触期间或接触后(例如在步骤a)期间或之后)所述C端标记的减少指示所述指示蛋白的切割；优选地，其中在与所
述梭菌神经毒素接触期间或接触后(例如，在步骤a)期间或之后)所述C端标记的减少证实所述指示蛋白的切割。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述细胞经基因工程化以表达(或过表达)所述指示蛋白。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过将编码所述指示蛋白的核酸引入细胞来产生(例如步骤a的)细胞群或重组细胞。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将编码所述指示蛋白的核酸引入重组细胞或细胞群(例如步骤a的重组细胞或细胞群)。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述指示蛋白在不存在所述梭菌神经毒素或其蛋白水解活性结构域的情况下不被切割。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述指示蛋白在细胞中不易被降解，但在其切割后，所得片段之一(优选C端片段)易被降解。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述指示蛋白包含C端标记，并且在不存在所述梭菌神经毒素或其蛋白水解活性结构域的情况下，所述C端标记不从所述指示蛋白中释放(例如被切割掉)。21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述指示蛋白包含C端标记，并且全长指示蛋白在细胞中不易被降解，但是在其切割后，得到的C端片段易被降解，并且所述C端片段的降解导致所述C端标记的降解。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述指示蛋白包含C端标记，并且全长指示蛋白在细胞中不易被降解，但是在其切割后，得到的C端片段易被降解，并且所述C端片段的降解导致所述C端标记的降解，通过测量细胞与梭菌神经毒素接触后来自所述C端标记的信号确定所述指示蛋白的切割；优选地，其中在与所述梭菌神经毒素接触期间或之后(例如在步骤a)期间或之后)所述C端标记的减少指示所述指示蛋白的切割；更优选地，其中在与所述梭菌神经毒素接触期间或之后(例如在步骤a)期间或之后)所述C端标记的减少证实所述指示蛋白的切割。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述接触之后，所述细胞被裂解并且使所得细胞裂解物与抗体接触并进行蛋白质印迹。24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a)的细胞包含编码对所述梭菌神经毒素具有结合亲和力的受体的外源核酸和/或提供对所述梭菌神经毒素具有结合亲和力的神经节苷脂的表达的外源核酸；优选编码所述受体的外源核酸和提供所述神经节苷脂表达的外源核酸。25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括在第一接触步骤(例如步骤a))之前将外源核酸引入细胞中，所述外源核酸编码：梭菌神经毒素受体或具有结合梭菌神经毒素能力的其变体或片段；和/或神经节苷脂合成途径的酶，或具有此类酶的催化活性的其变体或片段。26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a)的细胞包含编码所述神经节苷脂合成途径的酶(或具有此类酶的催化活性的其变体或片段)的外源核酸。27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a)的细胞包含编码葡萄糖神经酰胺合酶、GalT
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I、GalNAcT、GM3合酶、GD3合酶、GT3合酶、半乳糖神经酰胺合酶、GM4合酶、
GalT
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II、ST
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IV或ST
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V、或具有此类酶的催化活性的其变体或片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：G，
申请(专利权)人：益普生生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：