一种表达靶向B7-H5的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物制造技术

本发明专利技术公开了一种表达靶向B7

【技术实现步骤摘要】
stem cells，iPSCs)等，这类细胞由于其强大的功能，并且可以一定程度地通过伦理限制，因此具有十分深远和广泛的应用前景。
[0005]因此，开发一种可以在人体中表达靶向B7
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H5的shRNA和/或shRNA
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miR及分泌该靶向B7
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H5的shRNA和/或shRNA
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miR的外泌体的多能干细胞或其衍生物具有重要意义。
[0006]但是，无论是自体iPSCs细胞库，还是免疫配型PSCs细胞库的构思或建立都需要花费极大的财力、物力和人力。同种异基因供受体的器官、组织或细胞移植的分子免疫学基础主要是基于经典的主要组织相容性复合体MHC
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I和MHC
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II(人又作HLA
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I、HLA
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II)的配型。截至2019年6月，已鉴定和命名的HLA系统等位基因已超过20000个，仅经典的HLA
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A、B、C的等位基因数分别都超过5000个，这些经典的HLA
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I/II型等位基因各种可能的随机组合将是天文数字，并且随着新的等位基因的发现组合数随之增加，给器官、组织、细胞移植前的组织配型及供体选择带来极大的障碍，也给构建覆盖人群免疫配型PSCs细胞库带来巨大的困难。
[0007]于是，构建同种异体免疫兼容的通用型PSCs迫在眉睫。近年已有许多报道通过敲除B2M、CIITA等基因，实现HLA
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I和HLA
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II细胞表面或本身基因的缺失表达，进而使细胞具备免疫耐受或逃逸T/B细胞特异性免疫应答，产生免疫兼容的通用型PSCs，为更广泛的通用型PSCs源细胞、组织、器官应用奠定了重要的基础。也有报道细胞过表达CTLA4
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Ig、PD
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L1从而抑制同种异的免疫排斥。最近又有报道，在敲除B2M、CIITA的同时，敲入CD47，从而使细胞获得了逃逸除特异性免疫应答外，还具备免疫耐受或逃逸NK等细胞的固有免疫应答，从而使细胞具备了更加全面更强的免疫兼容特性。然而，这些方案要么免疫兼容不彻底，仍有通过其他途径发生同种异体的免疫排斥；要么彻底消除同种异体免疫排斥应答，但使供体源移植物的细胞本身同时丧失了抗原提呈的能力，这给受体带来了极大的致瘤性和病毒感染等疾病的风险。
[0008]为此，也有报道，不直接敲除B2M，而敲除HLA
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A、HLA
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B或一并敲除CIITA的同时，保留HLA
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C，并构建12个覆盖人群超过90％的HLA
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C免疫配型抗原，以此达到移植物的细胞仍具备一定程度的抗原提呈功能，并且同时能够通过HLA
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C抑制NK细胞的固有免疫应答。但这类细胞，一来，HLA
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I类抗原提呈的抗原类型缩小了三分之二以上，能够提呈的抗原完整性极大地不可逆的缩小，对于各种肿瘤、病毒以及其他疾病抗原的提呈具有极大的偏向性，仍然保留了相当程度的致瘤和病毒感染等疾病的风险，在CIITA同时敲除的情况下其致病风险更高；二来，12种高频率免疫配型的HLA
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C抗原种族差异很大，通过我们核实计算部分地区仅能占到70％的比例，而中国、印度等人口大国目前尚未有权威的大样本量的HLA数据展示，这样制备出来的通用型PSCs使用仍受到巨大的配型空缺考验；第三，这种方法会经历数次反复的基因编辑工作，按每次基因编辑至少两轮单细胞分离培养计，整个过程至少需要六轮以上的单细胞分离培养，这些流程不可避免且极大概率地因多次基因编辑脱靶或染色质不稳定或因大量单细胞传代增殖造成细胞各种不可预测的突变，进而诱发致癌、代谢疾病等各种问题。由此可见，这类免疫兼容方案亦为“过渡时期”的权宜之计，仍有许多问题没有更好的解决。
[0009]此外，还有人设计通过诱导自杀基因在供体组织、细胞致病后诱导杀死，这样做的后果将产生严重的组织坏死、细胞因子风暴等不可预知的疾病风险问题，并且这类设计的细胞杀死后将不复存在合适的供体细胞、组织和器官又是一大难题。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于提供一种多能干细胞或其衍生物；
[0011]本专利技术的另一目的在于提供一种外泌体；
[0012]本专利技术的再一目的在于提供所述多能干细胞或其衍生物和/或所述外泌体在制备B7
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H5高表达肿瘤治疗药物中的应用。
[0013]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0014]本专利技术的第一个方面，提供一种多能干细胞或其衍生物，所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有靶向B7
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H5的shRNA和/或shRNA
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miR的表达序列。
[0015]本专利技术研究发现，在多能干细胞或其衍生物中导入靶向B7
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H5的shRNA/shRNA
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miR表达序列后，多能干细胞或其衍生物中分泌的外泌体中包含高丰度的靶向B7
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H5的shRNA/shRNA
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miR以及加工成熟的siRNA，外泌体携带这些效应RNA分子与靶细胞结合，然后将其释放，从而阻断B7
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H5通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复T细胞活性，其能够有效清除肿瘤细胞。
[0016]所述靶向B7
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H5的shRNA和/或shRNA
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miR的序列如SEQ ID NO.101～SEQ ID NO.103所示。
[0017]本专利技术的第二个方面，提供一种多能干细胞或其衍生物，所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有靶向B7
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H5的shRNA和/或shRNA
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miR的表达序列，所述多能干细胞或其衍生物基因组的B2M基因和/或CIITA基因被敲除。
[0018]当B2M和CIITA基因被敲除后，其完全消除HLA
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I和HLA
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II类分子产生的影响，因此，其肿瘤治疗效果最佳。
[0019]本专利技术的第三个方面，提供一种多能干细胞或其衍生物，所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有靶向B7
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H5的shRNA和/或shRNA
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miR的表达序列，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入有第一核酸分子；
[0020]且，所述多能干细胞或其衍生物中的免疫应答相关基因的3
’
UTR区域导入有第二核酸分子；
[0021]所述第一核酸分子编码介导RNA干扰的小核酸分子，所述小核酸分子特异性靶向第二核酸分子的转录产物，且所述小核酸分子不靶向所述多能干细胞或其衍生物的任何其他的mRNA或lncRNA。
[0022]本技术方案中，所述第一核酸分子编码的小核酸分子能够与免疫应答相关基因3
’
UTR区域导入的第二核酸分子的转录本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有靶向B7
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H5的shRNA和/或shRNA
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miR的表达序列。2.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述靶向B7
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H5的shRNA和/或shRNA
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miR的靶序列如SEQ ID NO.101～SEQ ID NO.103所示。3.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的B2M和/或CIITA基因被敲除。4.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入有第一核酸分子；且所述多能干细胞或其衍生物中的免疫应答相关基因的3
’
UTR区域导入有第二核酸分子；所述第一核酸分子编码介导RNA干扰的小核酸分子，所述小核酸分子特异性靶向第二核酸分子的转录产物，且所述小核酸分子不靶向所述多能干细胞或其衍生物的任何其他的mRNA或lncRNA。5.根据权利要求4所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述小核酸分子包括短干扰核酸、短干扰RNA、双链RNA，优选为miRNA、shRNA、shRNA
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miR中的至少一种。6.根据权利要求5所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述多能干细胞或其衍生物来源于人类；所述小核酸分子的序列为不靶向人类任何mRNA或lncRNA的非人类物种的随机序列。7.根据权利要求4所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述第二核酸分子包括至少3个重复的小核酸分子序列的反向互补序列，优选为6～10个重复的小核酸分子序列的反向互补序列。8.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组还导入一种或多种免疫兼容分子表达序列，所述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。9.根据权利要求4或8所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述与免疫应答相关的基因包括：(1)主要组织相容性复合体基因，包括HLA
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A、HLA
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B、HLA
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C、HLA
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DRA、HLA
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DRB1、HLA
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DRB3、HLA
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DRB4、HLA
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DRB5、HLA
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DQA1、HLA
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DQB1、HLA
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DPA1和HLA
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DPB1中的至少一种；(2)主要组织相容性复合体相关基因，包括B2M和CIITA中的至少一种。10.根据权利要求8所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述免疫兼容分子包括以下的任一种或多种：(1)免疫耐受相关基因，包括CD47或HLA
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G；(2)HLA
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C类分子，包括人群中比例合计超过90％的HLA
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C复等位基因，或者超过90％的HLA
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C复等位基因与B2M构成的融合蛋白基因；(3)靶向主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA
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miR，所述主要组织相容性复合体基因包括HLA
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A、HLA
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B、HLA
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C、HLA
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DRA、HLA
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DRB1、HLA
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DRB3、HLA
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DRB4、HLA
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DRB5、HLA
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DQA1、HLA
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DQB1、HLA
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DPA1和HLA
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DPB1中的至少一种；(4)靶向主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA
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miR，所述主要组织相容性复合体相关基因包括B2M和CIITA中的至少一种。11.根据权利要求10所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：
所述靶向B2M的shRNA和/或shRNA
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miR的靶序列选自SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.10中的一种；所述靶向CIITA的shRNA和/或shRNA
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miR的靶序列选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.13中的一种；所述靶向HLA
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A的shRNA和/或shRNA
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miR的靶序列选自SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.16中的一种；所述靶向HLA
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B的shRNA和/或shRNA
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miR的靶序列选自SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.19中的一种；所述靶向HLA
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C的shRNA和/或shRNA
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miR的靶序列选自SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.22中的一种；所述靶向HLA
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DRA的shRNA和/或shRNA
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miR的靶序列选自SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.25中的一种；所述靶向HLA
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DRB1的shRNA和/或shRNA
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miR的靶序列选自SEQ ID NO.26～SEQ ID NO.28中的一种；所述靶向HLA
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DRB3的shRNA和/或shRNA
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miR的靶序列选自SEQ ID NO.29～SEQ ID NO.30中的一种；所述靶向HLA
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DRB4的shRNA和/或shRNA
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miR的靶序列选自SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.33中的一种；所述靶向HLA
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DRB5的shRNA和/或shRNA
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miR的靶序列选自SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淋立，陈月花，杨建国，莫健，
申请(专利权)人：王淋立，
类型：发明
国别省市：