一种人诱导多潜能干细胞、构建方法及其用途技术

本发明专利技术涉及一种多潜能干细胞，能定向分化为内皮祖细胞。本发明专利技术还涉及该多潜能干细胞的构建方法，及其在制药上的用途。本发明专利技术要求保护的基本技术方案是：一种人诱导多潜能干细胞，其特征在于F8基因B区编码序列中突变位点附近被框内缺失，或者整个B区编码序列被靶向缺失。本发明专利技术克服F8基因表达异常的方法，是提供一种修饰过的人诱导多潜能干细胞，其中非正常表达的F8基因B区编码序列中的突变位点附近序列被框内缺失或整个B区编码序列被靶向缺失。该人诱导多潜能干细胞的获得方法中，不需要构建供体载体，只需要直接合成ssODN即可，技术上实现相对容易，不会添加任何筛选基因，且效率较高。效率较高。

【技术实现步骤摘要】
一种人诱导多潜能干细胞、构建方法及其用途


[0001]本专利技术涉及一种多潜能干细胞(iPSCs)，能定向分化为内皮祖细胞。本专利技术还涉及该多潜能干细胞的构建方法，及其在制药上的用途。

技术介绍

[0002]血友病A(Hemophilia A,HA)是一种由于缺乏功能性的FVIII引起的X连锁遗传性出血性疾病，在男性中的发病率约为1/5000
[1,2]。其主要表现为不同程度的凝血功能障碍，临床上根据血浆FVIII 的凝血活性将其分为轻型，中间型和重型。轻型患者(FVIII凝血活性为5％
‑
30％)一般经历创伤或大手术后出血，约占HA患者的40％；中间型患者(FVIII凝血活性为1％
‑
5％)偶有自发出血，经历手术后出血严重，约占HA患者的10％；重型患者(FVIII凝血活性<1％)约占HA患者的50％，常会出现关节反复出血而致残，甚至可能发生颅内出血而危及生命。
[0003]目前HA尚无根治方法，临床上对于该病主要采取替代疗法，即通过输注血浆分离的FVIII或重组的FVIII蛋白来预防出血发生，或是出血后及时输注来止血。但是FVIII的半衰期极短，常需终身反复输注，还存在潜在病毒感染的风险，更重要的是长期反复输注会产生中和性抗体从而导致治疗无效
[3,4]。
[0004]HA是由于F8基因突变导致其产生的FVIII分子结构缺陷或FVIII含量减少而不能发挥正常的凝血功能引起的。F8作为已克隆的最大基因之一，全长达186kb
[5]，包含26个外显子，其中14号外显子是其最大的外显子(3.1kb)。F8的突变类型很多，至今人类突变数据库(The Human Gene MutationDatabase,HGMD)记录的突变种类已有3231种，包括错义突变、无义突变、小片段缺失与插入等，导致FVIII功能降低或丧失
[6]。
[0005]F8编码产生含2351个氨基酸的前体多肽，经过一系列加工修饰形成含2332个氨基酸的FVIII 成熟蛋白。根据序列相似性，FVIII结构可以分为几个不同的功能区域，包括3个A区，1个B区和2个C区，结构组成为N
‑
A1
‑
A2
‑
B
‑
A3
‑
C1
‑
C2
‑
C(如图1所示)
[7,8]。其中A区中存在钙离子的结合位点，在内源性凝血途径中发挥作用。
[0006]FVIII在分泌过程中，单链形式的蛋白会被弗林蛋白水解酶切割产生由亚铜离子连接的一条重链 (A1
‑
A2
‑
B)和一条轻链(A3
‑
C1
‑
C2)组成的异源二聚体。经过凝血酶水解，切除了B区，形成由亚铜离子连接的A1，A2，A3
‑
C1
‑
C2，成为有活性的FVIII，即FVIIIa，从而发挥凝血活性(如图2 所示)
[7,9]。
[0007]此外，B区高度糖基化，有研究表明其与FVIII活性关系不大，缺失大部分B区并不会对FVIII 的活性产生影响
[10]。尽管在蛋白功能层面上，B区并不存在于最终发挥凝血活性的FVIII中，但在已收录的所有F8基因突变中，有近500种突变发生在B区编码序列中，其中90％以上的突变造成FVIII 蛋白翻译提前终止，丧失FVIII凝血功能，导致HA
[6]。
[0008]HA一直被认为是最有可能实现基因治疗的单基因遗传病之一。其中一种理想的方式是突变基因的原位修复或通过适当的原位基因编辑进行功能性矫正，即在缺陷基因的原位点通过同源重组的途径进行精确的基因修复或消除突变的致病性效应。这种方式不仅恢
复了基因的功能，同时还保留了基因的原位调控元件，最大限度的将突变基因转变成跟正常人一致的生理状态。目前已有针对F8基因22 号内含子倒位型和1号内含子倒位型突变的HA基因原位修复策略
[11,12]。另一种基因治疗方式是基因替代，就是将带有启动子的治疗基因随机或者定点整合到缺陷细胞中，从而达到治疗的目的。由于技术的限制，目前进行的绝大部分基因治疗研究都是采用基因替代策略，例如有通过病毒介导的随机整合策略，非病毒载体介导的基因添加策略。
[0009]病毒介导的随机整合策略，就是使用包含有F8的编码序列以及启动子序列的质粒来转染F8缺陷的细胞，F8表达框有一定几率整合到基因组中，从而表达FVIII蛋白发挥作用。其缺点有：(1) F8很大，编码序列为8kb左右，即使是B区缺失的版本也大于4kb，再加上启动子序列，这个质粒很大，一般来说质粒越大，构建也越麻烦，整合效率也很低；(2)如果基因随机整合到基因组中，基因的表达可能会受到位置效应的影响，有可能表达效率低，甚至不能表达；(3)如果质粒整合到其他内源性基因位点则有可能破坏内源性基因或者激活原来不表达的有害基因，从而导致不好的后果。
[0010]而非病毒载体介导的基因添加策略有如下缺陷：(1)由于F8很大，编码序列为8kb左右，即使是B区缺失的版本也大于4kb，再加上启动子序列，质粒很大，一般来说质粒越大，构建也越麻烦，整合效率也很低，并且一般会引入外源筛选基因，外源基因片段的残留对于细胞的远期影响暂时不能明确；(2)外源基因整合至基因组的安全位点，其通过外源启动子和调控元件调控，有可能影响表达效率。
[0011]前期研究表明外源靶入B区缺失型的F8(B domain deletion F8,BDD
‑
F8)基因可以有效的表达功能性BDD
‑
FVIII
[13
‑
15]，而且采用重组的BDD
‑
FVIII同样具有一定的临床治疗效果
[10,16]。因此针对 F8基因B区编码序列的致病突变，本专利技术提出一个全新的基于原位基因编辑的治疗策略，即通过靶向基因编辑技术，将致病突变原位转变为B区编码序列微小框内缺失，从而恢复FVIII蛋白的翻译，消除这些突变造成FVIII翻译提前终止的致病性效应，恢复内源性FVIII的凝血活性。并在此基础上，进一步把框内缺失扩展至整个B区编码序列缺失，将此新型的HA原位基因治疗策略应用于所有B 区致病突变患者。

技术实现思路

[0012]本专利技术的目的之一是提供一种人诱导多潜能干细胞(iPSCs)，该多潜能干细胞能定向分化为内皮祖细胞，并在人体内正常表达F8基因。
[0013]本专利技术的另一目的是，提供一种获得上述iPSCs的方法。
[0014]本专利技术的再一目的是，依据所获得的iPSCs，提供一种其用于HA治疗的用途。
[0015]本专利技术要求保护的基本技术方案是：一种人诱导多潜能干细胞，其特征在于F8基因B区编码序列中突变位点附近被框内缺失，或者整个B区编码序列被靶向缺失。
[0016]本申请人所获得的保藏号为：C201本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人诱导多潜能干细胞，其特征在于在人凝血因子VIII基因原位位点B区编码序列中突变位点被框内缺失，或者整个B区编码序列被靶向缺失，从而使突变的读码框原位矫正为正常的读码框。2.一种人诱导多潜能干细胞，具有保藏号C201990。3.一种构建人诱导多潜能干细胞的方法，其特征在于通过CRISPR/Cas9与ssODN对来源于病人的HA
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iPSCs进行核转，获得原位B区编码序列微小框内缺失突变位点或整个B区编码序列靶向缺失的iPSCs；所述HA
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iPSCs是通过诱导所述病人尿液细胞获得的。4.根据权利要求3所述的构...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁德生，胡志青，周妙金，邬玲仟，
申请(专利权)人：上海苹谱医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：