阿尔茨海默病模型及其建立方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种阿尔茨海默病模型及其建立方法和用途，属于疾病模型技术领域。该方法包括以下步骤：细胞重编程：获取具有CLU位点突变的AD患者外周血样本，分离得到单核细胞；并将上述单核细胞扩增培养，加入OCT3/4、SOX2、KLF4、c

【技术实现步骤摘要】
阿尔茨海默病模型及其建立方法和用途


[0001]本专利技术涉及疾病模型
，特别是涉及一种阿尔茨海默病模型及其建立方法和用途。

技术介绍

[0002]阿尔茨海默病(AD)是最常见的一种痴呆病因，估计占痴呆病例的60
‑
80％。其最常见的病理特征为神经元外β
‑
淀粉样蛋白(Aβ)和神经元内tau蛋白的积蓄。最近，越来越多的证据支持γ
‑
氨基丁酸(GABA)能信号参与了AD的发生。GABA能信号异常参与了兴奋性和抑制性信号(E/I)的失衡，被认为是AD发病的重要驱动因素。Aβ的聚集、tau蛋白过度磷酸化和GABA能功能失常之间的恶性循环加剧了AD的发病进程。
[0003]随着全基因组关联研究对大规模人群的运用，筛选出CLU突变与AD的发生密切相关。CLU基因位于染色体8p21.1，它编码大脑中的主要载脂蛋白
‑
载脂蛋白J，也称为凝聚素(clusterin)。在生理条件下，CLU rs11136000T作为一个保护位点，与降低AD的风险相关。而CLU内含子区域的rs11136000C可通过炎症激活和Aβ清除减少聚集蛋白表达，加速AD的进程。然而，目前仍缺少这个位点突变的可靠的AD模型。
[0004]因此，本领域迫切需要开发一种新的实验模型，用于研究携带CLU位点突变的AD。

技术实现思路

[0005]基于此，有必要针对上述问题，提供一种阿尔茨海默病模型的建立方法，采用该方法建立得到的阿尔茨海默病模型，能够较好的还原阿尔茨海默病的发病过程，为探索AD的发病机制和药物筛选提供重要的依据。
[0006]一种阿尔茨海默病模型的建立方法，包括以下步骤：
[0007]细胞重编程：获取具有CLU位点突变的AD患者外周血样本，分离得到单核细胞；并将上述单核细胞扩增培养，加入OCT3/4、SOX2、KLF4、c
‑
MYC和仙台病毒进行转染，培养得到人源性诱导型神经前体细胞；
[0008]细胞分化：挑选上述人源性诱导型神经前体细胞克隆，加入PDL和Laminin进行扩增培养，培养预定时间后，再加入NEAA、N2、B27和Purmorphamine，使上述人源性诱导型神经前体细胞在向γ
‑
氨基丁酸能神经前体细胞分化，进行分化培养，得到阿尔茨海默病的γ
‑
氨基丁酸能神经元前体细胞(MGE)，即为阿尔茨海默病细胞模型。
[0009]上述阿尔茨海默病模型的建立方法，通过CLU位点突变的单核细胞诱导分化得到细胞模型，既避免了使用胚胎干细胞建模存在的遗传伦理和免疫排斥等风险，且具有重复性好，方法可靠等优势，所得AD模型能够很好的还原AD的发病过程，为探索AD的发病机制和药物筛选提供重要的依据。
[0010]在其中一个实施例中，所述细胞重编程步骤中，OCT3/4的浓度为(2
±
0.2)
×
105CIU/mL、SOX2的浓度为(2
±
0.2)
×
105CIU/mL、KLF4的浓度为(2
±
0.2)
×
105CIU/mL、c
‑
MYC的浓度为(2
±
0.2)
×
105CIU/mL、仙台病毒的浓度为(2
±
0.2)
×
105CIU/mL。
[0011]以上述条件进行细胞模型的培养和建立，可以在固定时间内定量扩增，具有实验方法重复性高的优点。
[0012]在其中一个实施例中，所述细胞重编程步骤中，待单核细胞扩增培养至14
±
1天时进行转染，转染后培养21
±
1天，得到人源性诱导型神经前体细胞(hiNPC)。选择上述时间点，具有时效性的优点。
[0013]在其中一个实施例中，所述细胞分化步骤中，PDL的浓度为0.1
±
0.01mg/mL、Laminin的浓度为0.01
±
0.01mg/mL。以上述条件进行细胞模型的分化培养，能够为细胞生长提供必需的糖蛋白，可支持细胞的生长和分化。
[0014]在其中一个实施例中，所述细胞分化步骤中，进行扩增培养后，将所述人源性诱导型神经前体细胞(hiNPC)以(1
±
0.3)
×
105的密度接种，使上述人源性诱导型神经前体细胞(hiNPC)向γ
‑
氨基丁酸能神经前体细胞(MGE)分化，分化培养15
±
1天。以上述条件进行细胞模型的分化培养，能够在相对固定的时间内稳定表达MGE标记，具有可重复性高的优势。
[0015]在其中一个实施例中，所述细胞分化步骤中，NEAA为1
×
、N2为1
×
、B27为1
×
，Purmorphamine的浓度为1.5μM。
[0016]在其中一个实施例中，该建立方法还包括以下步骤：
[0017]动物模型建立：取C57BL/6J小鼠，将上述阿尔茨海默病的MGE细胞注入小鼠海马齿状回区，同时皮下注射给予环孢素A，饲养小鼠，即得阿尔茨海默病动物模型。
[0018]采用上述方法建立得到的阿尔茨海默病小鼠模型，既能在代谢水平体现出阿尔茨海默病特征，还能在动物行为学表现出阿尔茨海默病特征，较好的还原了AD的发病过程，为探索AD的发病机制和药物筛选提供重要的依据。
[0019]在其中一个实施例中，所述动物模型建立步骤中，从对小鼠注射所述MGE细胞前一天开始，每天按照7
±
0.1mg/kg的剂量皮下注射予环孢素A，持续6
±
0.1个月。
[0020]本专利技术还公开了上述的阿尔茨海默病模型的建立方法得到的阿尔茨海默病细胞模型。
[0021]本专利技术还公开了上述的阿尔茨海默病模型的建立方法得到的阿尔茨海默病动物模型。
[0022]本专利技术还公开了上述的阿尔茨海默病细胞模型或阿尔茨海默病动物模型在研究老年痴呆发病机理和/或筛选治疗老年痴呆的药物中的用途。
[0023]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0024]本专利技术的阿尔茨海默病模型的建立方法，所建立的阿尔茨海默病细胞模型和动物模型，其人源性诱导神经前体细胞(hiNPC)由体细胞重编程而成，可用于对CLU位点突变的AD患者体细胞进行重组，获得AD特异性的hiNPC，直接反映出神经系统疾病的发病机制。
[0025]同时，本专利技术的模型建立方法，为首次建立CLU位点突变的人源化AD小鼠模型，且经试验证实，该模型产生AD相关的行为学和病理改变，且建立方法可靠、重复性好，使通过此方法建立研究和药物筛选的动物模型具有较高实操性。
[0026]本专利技术所建立的阿尔茨海默病细胞模型和动物模型，能很好的还原AD的发病过程，为探索AD的发病机制和药物筛选提供重要的依据。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种阿尔茨海默病模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：细胞重编程：获取具有CLU位点突变的AD患者外周血样本，分离得到单核细胞；并将上述单核细胞扩增培养，加入OCT3/4、SOX2、KLF4、c
‑
MYC和仙台病毒进行转染，培养得到人源性诱导型神经前体细胞；细胞分化：挑选上述人源性诱导型神经前体细胞克隆，加入PDL和Laminin进行扩增培养，培养预定时间后，再加入NEAA、N2、B27和Purmorphamine，使上述人源性诱导型神经前体细胞在向γ
‑
氨基丁酸能神经前体细胞分化，进行分化培养，得到阿尔茨海默病的γ
‑
氨基丁酸能神经元前体细胞，即为阿尔茨海默病细胞模型。2.根据权利要求1所述的阿尔茨海默病模型的建立方法，其特征在于，所述细胞重编程步骤中，OCT3/4的浓度为(2
±
0.2)
×
105CIU/mL、SOX2的浓度为(2
±
0.2)
×
105CIU/mL、KLF4的浓度为(2
±
0.2)
×
105CIU/mL、c
‑
MYC的浓度为(2
±
0.2)
×
105CIU/mL、仙台病毒的浓度为(2
±
0.2)
×
105CIU/mL。3.根据权利要求2所述的阿尔茨海默病模型的建立方法，其特征在于，所述细胞重编程步骤中，待单核细胞扩增培养至14
±
1天时进行转染，转染后培养21
±
...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓文斌，陈春霞，郭莹，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：