经修饰的红细胞及其在递送活性剂中的用途制造技术

本公开提供用于共价修饰红细胞(RBC)的至少一种膜蛋白的方法，所述方法包括：在分选酶存在下，使RBC与包含分选酶识别基序和活性剂的分选酶底物接触，其中所述接触在适于所述分选酶通过分选酶介导的反应将分选酶底物缀合到RBC的至少一种膜蛋白上的条件下进行，其中该分选酶识别基序在N端到C端方向的第5位处包含可选取代的羟基羧酸。本公开还提供通过本公开的方法获得的具有与之连接的活性剂的红细胞(RBC)、以及该RBC在递送活性剂如药物和探针中的用途。中的用途。中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经修饰的红细胞及其在递送活性剂中的用途


[0001]本公开一般涉及经修饰的红细胞(RBC)，更具体而言，涉及经共价修饰的RBC及其在递送药物和探针中的用途。

技术介绍

[0002]用于在多种人类疾病治疗中延长药物存留时间的药物递送系统的最新发展引起了广泛关注。然而，许多系统仍然面临各种挑战和局限，例如稳定性差、不需要的毒性和免疫反应[1]。红细胞(RBC)是人体中最常见的细胞类型，由于其独特的生物学特性，已作为理想的体内药物递送系统被广泛研究了30多年，所述特性包括：(i)广泛的体内循环范围；(ii)作为生物材料具有良好的生物相容性，具有较长的体内存活时间；(iii)大的表面积体积比；(iv)没有细胞核、线粒体和其他细胞器。
[0003]通过直接包载、非共价连接外源肽，或通过使蛋白质与RBC表面蛋白特异性抗体融合来安装蛋白质，RBC已被开发为药物递送载体。已经证明，这种修饰的红细胞在体内应用方面存在局限性。例如，包载会破坏细胞膜，从而影响工程化细胞的体内存活。此外，聚合物颗粒与红细胞的非共价连接很容易解离，有效载荷将在体内很快降解。
[0004]细菌分选酶是能够以共价和位点特异性方式修饰蛋白质的转肽酶[2]。来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的野生型分选酶A(wt SrtA)识别LPXTG基序并在苏氨酸和甘氨酸之间切割以在酶和底物蛋白之间形成共价酰基
‑
酶中间体。该中间体通过肽或蛋白质的亲核攻击而解体，其中所述肽或蛋白质通常在N端具有三个连续的甘氨酸残基(3
×
甘氨酸，G3)。以前的研究已经在RBC上遗传过表达C端具有LPXTG基序的膜蛋白KELL，它可以通过使用wt SrtA连接到3
×
甘氨酸或G
(n≥3)
修饰的蛋白质/肽的N端[3]。这些携带药物的RBC已在动物模型上显示出治疗疾病的功效。然而，这需要对造血干细胞或祖细胞(HSPCs)进行工程改造以及将这些细胞分化为成熟RBC的步骤，这极大地限制了其应用。
[0005]使用SrtA将蛋白质共价标记到细胞上，在科学研究和临床应用中具有广阔的前景。然而，此方法有一定的限制：首先，需要将LPXTG基序序列构建到有效载荷蛋白的C端；第二，由于转肽酶反应是可逆的，需要过量的亲核标记试剂以确保反应平衡朝向有利于产物形成的方向。
[0006]因此，本领域仍然需要改进的RBC递送系统。
[0007]专利技术概述
[0008]在一个一般方面，本专利技术提供了一种红细胞(RBC)，其具有与其连接的活性剂，其中该活性剂通过分选酶介导的反应，且优选地通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε
‑
氨基缀合，与RBC的至少一种内源性非工程化膜蛋白连接。在一些实施方案中，分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε
‑
氨基缀合，至少发生在位于所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点的甘氨酸
(n)
和/或赖氨酸ε
‑
氨基基团上，优选地n为1或2。
[0009]在一些实施方案中，RBC未经过基因工程改造以表达包含分选酶识别基序或亲核
受体序列的蛋白质，并且优选地RBC是天然RBC，例如天然人RBC。
[0010]在一些实施方案中，分选酶能够介导甘氨酸
(n)
缀合和/或赖氨酸侧链ε
‑
氨基基团缀合，优选缀合在所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点，优选n为1或2。
[0011]在一些实施方案中，分选酶是分选酶A(SrtA)，例如金黄色葡萄球菌转肽酶A变体(mgSrtA)。例如，mgSrtA包含与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成。
[0012]在一些实施方案中，活性剂在与RBC连接之前，在其C
‑
末端包含分选酶识别基序。
[0013]在一些实施方案中，分选酶识别基序包含或基本上由或由选自以下的氨基酸序列组成：LPXTG、LPXAG、LPXSG、LPXLG、LPXVG、LGXTG、LAXTG、LSXTG、NPXTG、MPXTG、IPXTG、SPXTG、VPXTG、YPXRG、LPXTS和LPXTA，其中，X是任何氨基酸；或包含或基本上由或由选自以下的氨基酸序列组成：LPXT*Y、LPXA*Y、LPXS*Y、LPXL*Y、LPXV*Y、LGXT*Y、LAXT*Y、LSXT*Y、NPXT*Y、MPXT*Y、IPXT*Y、SPXT*Y、VPXT*Y和YPXR*Y，其中，*表示具有式CH2OH
‑
(CH2)
n
‑
COOH的、可选取代的羟基羧酸，n为0至3的整数；并且X和Y独立地表示任何氨基酸。
[0014]在一些实施方案中，所述活性剂包括结合剂、治疗剂或检测剂，包括例如蛋白质、肽如寡聚血管紧张素转换酶2(ACE2)的胞外结构域、抗体或其功能性抗体片段、抗原或表位例如肿瘤抗原、MHC
‑
肽复合物、药物如小分子药物(例如抗肿瘤剂，例如化疗剂)、酶(例如功能性代谢酶或治疗性酶)、激素、细胞因子、生长因子、抗微生物剂、探针、配体、受体、免疫耐受诱导肽、靶向部分、前药或其任何组合。
[0015]在一些实施方案中，与活性剂连接的RBC表面上的至少一种内源性非工程化膜蛋白包含A1‑
LPXT
‑
P1结构，其中LPXT与P1中的甘氨酸
(n)
连接；和/或包含A1‑
LPXT
‑
P2结构，其中LPXT与P2中的赖氨酸侧链ε
‑
氨基连接，其中n优选为1或2，A1表示活性剂，P1和P2独立地表示所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域，X表示任何氨基酸。
[0016]在另一个方面，本专利技术提供了一种红细胞(RBC)，其具有与RBC表面上的至少一种内源性、非工程化膜蛋白连接的活性剂，其中与活性剂连接的所述至少一种内源性非工程化膜蛋白包含A1‑
LPXT
‑
P1结构，其中LPXT与P1中的甘氨酸
(n)
连接；和/或包含A1‑
LPXT
‑
P2结构，其中LPXT与P2中的赖氨酸侧链ε
‑
氨基连接，其中n优选为1或2，A1表示活性剂，P1和P2独立地表示所述至少一种内源性非工程化膜蛋白，X表示任何氨基酸。在一些实施方案中，所述连接至少发生在位于所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点的甘氨酸
(n)
和/或赖氨酸ε
‑
氨基基团上，优选n为1或2。
[0017]在另一个方面，本专利技术提供了一种用于共价修饰红细胞(RBC)的至少一种膜蛋白的方法，所述方法包括：在分选酶存在下，使RBC与包含分选酶识别基序和活性剂的分选酶底物接触，其本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于共价修饰红细胞(RBC)的至少一种膜蛋白的方法，所述方法包括：在分选酶存在下，使RBC与包含分选酶识别基序和活性剂的分选酶底物接触，其中所述接触在适于所述分选酶通过分选酶介导的反应将分选酶底物缀合到RBC的至少一种膜蛋白上的条件下进行，其中所述分选酶底物包含结构A1‑
Sp
‑
M，其中A1表示活性剂，Sp表示一个或多个可选的间隔基，M表示分选酶识别基序，其中所述分选酶识别基序在其N端到C端方向的第5位处包含非天然氨基酸，其中该非天然氨基酸是具有式CH2OH
‑
(CH2)
n
‑
COOH的、可选取代的羟基羧酸，其中n是0至3的整数，优选n＝0。2.权利要求1的方法，其中M包含选自以下的氨基酸序列、或基本上由其组成或由其组成：LPXT*Y、LPXA*Y、LPXS*Y、LPXL*Y、LPXV*Y、LGXT*Y、LAXT*Y、LSXT*Y、NPXT*Y、MPXT*Y、IPXT*Y、SPXT*Y、VPXT*Y和YPXR*Y，其中*表示可选取代的羟基羧酸；并且X和Y独立地表示任何氨基酸。3.权利要求2的方法，其中M包含选自以下的氨基酸序列、或基本上由其组成或由其组成：LPXT*G、LPXA*G、LPXS*G、LPXL*G、LPXV*G、LGXT*G、LAXT*G、LSXT*G、NPXT*G、MPXT*G、IPXT*G、SPXT*G、VPXT*G、YPXR*G、LPXT*S和LPXT*A，优选M为LPET*G，*为2
‑
羟基乙酸。4.权利要求1
‑
3中任一项的方法，其中该一个或多个Sp选自以下类型：(1)零长度型；(2)胺
‑
巯基型；(3)同双官能NHS酯型；(4)同双官能亚氨酸酯型；(5)羰基
‑
巯基型；(6)巯基反应型；和(7)巯基
‑
羟基型；并且优选该一个或多个Sp是NHS酯
‑
马来酰亚胺异双官能交联剂，如6
‑
马来酰亚胺基己酸和4
‑
马来酰亚胺基丁酸，并且所述活性剂包含暴露的巯基，优选暴露的半胱氨酸，更优选末端半胱氨酸，最优选C端半胱氨酸。5.权利要求1
‑
4中任一项的方法，其中所述至少一种膜蛋白是至少一种内源性非工程化膜蛋白，并且通过分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε
‑
氨基缀合，所述分选酶底物与RBC的该至少一种内源性非工程化膜蛋白缀合。6.权利要求5的方法，其中所述分选酶介导的甘氨酸缀合和/或分选酶介导的赖氨酸侧链ε
‑
氨基缀合至少发生在甘氨酸
(n)
和/或赖氨酸ε
‑
氨基上，优选地该至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点处，优选n为1或2。7.权利要求5或6的方法，其中所述RBC未经过基因工程改造以表达包含分选酶识别基序或亲核受体序列的蛋白质，并且优选地所述RBC是天然RBC，例如天然人RBC。8.权利要求1
‑
7中任一项的方法，其中所述分选酶能够介导甘氨酸
(n)
缀合和/或赖氨酸侧链ε
‑
氨基缀合，优选地缀合在所述至少一种内源性非工程化膜蛋白的胞外结构域的内部位点，优选n为1或2。9.权利要求8的方法，其中分选酶是分选酶A(SrtA)，例如金黄色葡萄球菌转肽酶A变体(mgSrtA)。10.权利要求9的方法，其中所述mgSrtA包含或基本上由或由与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸序列组成。11.权利要求1
‑
10中任一项的方法，其中所述活性剂包括结合剂、治疗剂或检测剂，包括例如蛋白质、肽如寡聚ACE2的胞外结构域、抗体或其功能性抗体片段、抗原或表位例如肿瘤抗原、MHC
‑
肽复合物如包含HPV的抗原肽(例如YMLDLQPET肽)的复合物、药物例如小分子药物(例如抗肿瘤剂，例如化疗剂)、酶(例如功能性代谢酶或治疗性酶，如尿酸氧化酶)、激
素、细胞因子、生长因子、抗微生物剂、探针、配体、受体、免疫耐受诱导肽、靶向部分、前药或其任何组合。12.权利要求1
‑
11中任一项的方法，其中所述在BRC表面上共价修饰的至少一种膜蛋白包含结构A1‑
L1‑
P1，其中L1与P1中的甘氨酸
(n)
连接、和/或结构A1‑
L1‑
P2，其中L1与P2中赖氨酸的侧链ε
‑
氨基连接，其中n优选为1或2；A1表示活性剂；L1选自LPXT、LPXA、LPXS、LPXL、LPXV、LGXT、LAXT、LSXT、NPXT、MPXT、IPXT、SPXT、VPXT和YPXR；P1和P2独立地表示至少一种膜蛋白；X表示任何氨基酸。13.通过权利要求1
‑
12中任一项的方法获得的红细胞(RBC)。14.一种组合物，其包含权利要求13的红细胞和任选地生理学上可接受的载体。15.一种用于在有需要的受试者中诊断、治疗或预防病症、病状或疾病的方法，包括向所述受试者施用权利要求13的红细胞或权利要求14的组合物。16.权利要求15的方法，其中所述病症、病状或疾病选自肿瘤或癌症如宫颈癌、代谢疾病如溶酶体贮积症(LSD)和痛风、细菌感染、病毒感染如人乳头状瘤病毒(HPV)感染和冠状病毒感染例如SARS
‑
CoV或SARS
‑
CoV
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2感染，自身免疫性疾病和炎性疾病。17.一种将活性剂递送给有需要的受试者的方法，包括向所述受试者施用权利要求13的红细胞或权利要求14的组合物。18.一种增加活性剂在受试者中的循环时间或血浆半衰期的方法，所述方法包括：提供包含分选酶识别基序和活性剂的分选酶底物，以及在分选酶存在下在适宜条件下缀合分选酶底物，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：高晓飞，黄彦杰，聂小千，
申请(专利权)人：西湖生物医药科技杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：