非病毒方法制备稳定高表达嵌合受体的NK细胞技术

本发明专利技术提供了应用非病毒方法制备稳定高表达嵌合受体的自然杀伤(NK)细胞的方法及其应用，所述方法包括：(1)利用转座子系统将嵌合受体的编码基因转入自然杀伤细胞，得到初始的嵌合受体修饰的自然杀伤细胞；(2)利用人工抗原呈递细胞扩增所述初始的嵌合受体修饰的自然杀伤细胞。本发明专利技术应用转座子系统在NK细胞中引入稳定高表达的嵌合受体，与现有技术相比，本发明专利技术的方法操作简便、快速、高效、准确、重复性好、成本效益高、并有较好的安全性，由此制备的嵌合受体修饰的NK细胞具有较强的肿瘤杀伤能力，在体外展现了较好的抗肿瘤效果，在生物医学各个领域、特别是疾病的细胞治疗领域具有广阔的应用前景。广阔的应用前景。广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
非病毒方法制备稳定高表达嵌合受体的NK细胞


[0001]本专利技术属于医学生物工程
，涉及应用非病毒方法制备稳定高表达嵌合受体修饰的NK细胞的 方法及其应用。

技术介绍

[0002]自然杀伤(NK)细胞是先天性免疫系统的重要组成部分，在外周血淋巴细胞中NK细胞的比例约10％， 是继B细胞和T细胞之后的第三大淋巴细胞群体。NK细胞具有多种生物学功能，是人体对抗感染和肿瘤 的第一道防线。NK细胞的功能通过精密且复杂的激活型和抑制型受体网络进行调节。大部分循环的NK 细胞处于静息期，可以被细胞因子活化并浸润到病原体感染或含有恶性细胞的组织中。当NK细胞的受体 与相应的配体结合后，NK细胞还可以分泌一些细胞因子，例如干扰素(IFN)-γ，发挥免疫调节作用。 NK细胞的主要功能之一是对机体进行免疫监督，研究者已发现NK细胞参与控制多种疾病的发生发展。 对哺乳动物细胞(包括人体细胞)的一些体外研究以及对小鼠和大鼠的体内研究表明，NK细胞可以将肿 瘤细胞识别为靶标，并在体内控制肿瘤细胞的生长、转移和扩散。一项为期11年的随访流行病学调查显 示，外周血NK细胞活性降低会增加成人患癌症的风险。不仅如此，体外实验和动物实验还发现，NK细 胞对SARS、H5N1、埃博拉、寨卡、登革热、HIV等多种突发病毒感染疾病具有良好的抑制和消除能力。
[0003]与MHC限制的T细胞不同，NK细胞不需要进行HLA配型，因此可以作为异源性的现货细胞药品 对病人进行免疫治疗，在临床上具有重要的应用前景。基于自体或同种异体NK细胞的过继性疗法在临床 上已经应用于抗肿瘤、抗病毒感染，特别是异体NK细胞对于治疗血液系统癌症显示出良好的治疗效果。
[0004]尽管NK细胞具有强大的免疫效应功能，但是许多癌细胞和病毒会通过抗原逃逸和免疫抑制等机制来 抑制NK细胞的功能。由于这些原因，在过去的十年时间中，科学家们一直在探索通过基因工程的方法来 增强NK细胞的功能活性并避免免疫抑制，例如通过表达内源性细胞因子来增强过继回输后的NK细胞的 增殖能力，抑制免疫抑制信号或增强NK细胞的杀伤功能等。后一种方法目前主要通过修饰嵌合抗原受体 (CARs)使NK细胞重新定向于肿瘤细胞。嵌合抗原受体是将抗体的ScFv与胞内信号转导结构融合在一 起，ScFv用于介导识别和结合肿瘤细胞表面抗原。
[0005]然而，原代NK细胞对于基因转染的抵抗力较强，这导致NK细胞对多种载体系统的摄取率低，NK 细胞的转基因表达量低，只有病毒载体在原代NK细胞中实现了较高的基因转移效率。目前，对原代NK 细胞进行嵌合受体的修饰一般通过电转嵌合受体编码基因的mRNA或者采用慢病毒/逆转录病毒感染的方 式来实现。mRNA电转只能使嵌合受体编码基因瞬时表达，且体外合成mRNA的成本较高，临床上需要 多次注射，治疗费用较高。慢病毒/逆转录病毒转染则可以制备嵌合受体基因稳定表达的NK细胞，然而 与NK细胞株如NK92比较，原代NK细胞、尤其是外周血NK细胞感染难度极大，迄今为止，只有少数 科研团队成功应用慢病毒/逆转录病毒制备嵌合抗原受体修饰的原代NK细胞，经多次重复感染后，其转 基因在终
产品中的表达比例在20％～80％之间，其中逆转录病毒的转染效率高于慢病毒。然而，由于逆转 录病毒和/或慢病毒本身是致病原，具有插入突变的潜力，对人类临床试验的实施构成了重大的监管障碍。 不仅如此，在细胞系中大规模制造病毒载体存在成本高、效率低的问题，对嵌合受体修饰的NK细胞的临 床转化构成了障碍，显著提高了生产成本。
[0006]为了克服病毒载体系统的上述局限性，研究者进一步探索了非病毒载体的可行性。通常，非病毒载体 系统为人工合成系统，不依赖于任何病毒成分或哺乳动物细胞进行生产制造，成本低，同时有利于避免使 用病毒载体带来的免疫问题。DNA转座子是一种典型的非病毒载体系统，具有基因可持续性表达、免疫 原性低、成本低、效率高等优点。
[0007]在自然界中，DNA转座子是包含转座酶基因的离散DNA片段，其两侧是包含转座子结合位点的反向 末端重复序列(ITRs)。转座的过程为转座酶结合到TIRs上，从一个位置“剪切”转座，并“粘贴”到另 一个新的位置。基于转座子的载体系统，如睡美人(SB)系统、piggyBac(PB)系统、Tol转座子系统， 是利用转座的方法，将转基因引入到宿主基因组。与逆转录病毒载体类似，稳定的基因组整合到宿主中可 以实现长期高效的转基因表达。SB和PB转座子都已成功用于修饰T细胞，使其表达CD19特异性CAR。 然而目前尚无采用转座子系统制备转基因修饰的原代NK细胞的报道。

技术实现思路

[0008]为了克服目前的技术手段对原代NK细胞进行嵌合受体修饰效率低的问题，以及使用逆转录病毒造成 的监管障碍、生产成本高的问题，本专利技术提供了一种非病毒的制备嵌合受体修饰的NK细胞方法，应用转 座子系统在NK细胞中引入稳定高表达的嵌合受体，实现对NK细胞的高效遗传修饰。
[0009](1)应用转座子系统将嵌合受体的编码基因转入NK细胞；
[0010](2)利用人工抗原呈递细胞扩增嵌合受体修饰的NK细胞。
[0011]所述NK细胞是人原代NK细胞，可以来自人的外周血、脐带血或诱导多能干细胞(iPSC)等。
[0012]所述嵌合受体包括嵌合抗原受体、嵌合转换受体、或其他应用DNA重组技术合成的嵌合受体。
[0013]步骤(1)所述转座子系统包括piggyBac转座子系统、Sleeping Beauty转座子系统或Tol2转座子系统 等。
[0014]优选地，步骤(1)所述转座子系统包括转座子元件和转座酶元件；所述转座子元件包括转座子5
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反 向末端重复序列(5
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ITR)和3
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反向末端重复序列(3
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ITR)，在5
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ITR和3
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ITR之间设有两个绝缘子，在 两个绝缘子之间包括启动子和嵌合受体的编码基因，所述转座子可以是质粒或线性化的核酸片段；所述转 座酶元件可以由质粒或线性化的核酸片段编码，也可以由mRNA编码，也可以是蛋白。
[0015]优选地，所述转座酶的核酸序列和转座子的核酸序列可以在一个载体上，也可以在两个不同的载体上。
[0016]优选地，所述应用转座子系统将嵌合受体的编码基因转入NK细胞的方法包括：电穿孔的方法、化学 试剂转染的方法、以及其他非病毒转染的方法等。
[0017]更优选地，通过电穿孔的方法将转座子系统的相关载体转入原代NK细胞中。
[0018]优选地，步骤(1)所述应用转座子系统将转基因转入NK细胞前，NK细胞可以预先进行活化，也 可以预先不进行活化。
[0019]优选地，若NK细胞预先进行活化，可以采用人工抗原呈递细胞、饲养细胞、细胞因子、抗体或化合 物等进行活化。
[0020]优选地，若NK细胞预先进行活化，可以在NK细胞活化后的0～14天，例如1、2、3、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用非病毒转座子系统和人工抗原呈递细胞制备嵌合受体修饰的自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)利用转座子系统将嵌合受体的编码基因转入自然杀伤细胞，得到初始的嵌合受体修饰的自然杀伤细胞；(2)利用人工抗原呈递细胞扩增所述初始的嵌合受体修饰的自然杀伤细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述自然杀伤细胞包括人原代自然杀伤细胞；所述人原代自然杀伤细胞来源于外周血、脐带血或诱导性多能干细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嵌合受体包括嵌合抗原受体和/或嵌合转换受体。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述转座子系统包括piggyBac转座子系统、Sleeping Beauty转座子系统或Tol2转座子系统。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述转座子系统包括转座子元件和转座酶元件。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转座子元件包括转座子5
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反向末端重复序列和3
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反向末端重复序列；所述5
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反向末端重复序列和3
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反向末端重复序列之间含有两个绝缘子；所述两个绝缘子之间含有启动子和嵌合受体的编码基因；所述转座子元件为质粒或线性化核酸片段。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转座酶元件包括转座酶蛋白或编码转座酶的核酸分子；所述编码转座酶的核酸分子包括质粒、线性化核酸片段或mRNA。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转座子元件和转座酶元件连接在同一表达载体上。9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转座子元件和转座酶元件在不同的表达载体上。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述转座子系统通过电穿孔和/或化学试剂转入自然杀伤细胞。11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之前还包括活化自然杀伤细胞的步骤。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述活化自然杀伤细胞采用人工抗原呈递细胞、饲养细胞、细胞因子、抗体或...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖琳，裘新红，彭群武，张亮，朱苏闽，徐芳芳，
申请(专利权)人：杭州优凯瑞医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：