一种先天性白内障疾病动物模型构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种先天性白内障疾病动物模型的构建方法，先针对小鼠GJA8基因的第二个外显子区域设计gRNA靶标位点序列，扩增同源臂和cKO区域，分别连接到载体上；将构建好的质粒电转ES细胞向囊胚中注射阳性克隆，并转移入小鼠体内，出生小鼠经发育成熟后，得到首建者小鼠；再与野生型小鼠交配，得基因突变的杂合子小鼠F1代；最后将基因型相同的杂合子小鼠F1代交配，得基因突变纯合子小鼠F2代。本发明专利技术提供的先天性白内障疾病动物模型的构建方法，可得到表现出先天性白内障的典型特征如表现出晶状体变性混浊、晶状体上皮凋亡等特征，该动物模型可用于先天性白内障疾病的研究和筛选治疗先天性白内障疾病的药物中，其应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
一种先天性白内障疾病动物模型构建方法及应用
本专利技术属于生物学基因编辑
，涉及一种先天性白内障疾病动物模型构建方法及应用。
技术介绍
先天性白内障是指在出生时或出生后不久出现的晶体混浊，其发生率为0.6-6/10000人口，是造成儿童失明及弱视的重要原因，占儿童致盲性眼病第二位。基于我国庞大人口技术，先天性白内障患者可达百万，给家庭及社会带来沉重负担。虽然先天性白内障手术技法不断改进，且成功率不断提高。但儿童眼部解剖学、生理学特点及术后炎症反应较成人复杂，其弱视、后发障等术后并发症易发生，因此患者视力恢复较难达到期望效果。更为困难的是，目前对该病病因和病理机制仍缺乏深入系统研究，大量先天性白内障致病位点及基因致病机制尚不清楚，给预防、诊断及针对性治疗干预带来障碍。先天性白内障防治措施乏力的根本原因在于该病在早期胚胎及初生期的病因与病理机制缺乏深入研究。造成这种问题的原因主要有以下几个方面：1)因医学伦理范畴及该病的随机性，人类先天性白内障胚胎无法获取。2)临床表现的异质性强。该病临床表型差异较大，严重者在出生时即开始显现发病表型，并很快失明，而轻微患者一直到青年时才显现发病表型。3)致病基因多、遗传模式复杂。目前已知与先天性遗传性白内障确切相关基因已超过40个，包括以下几大类:晶状体蛋白基因(CRYAA、CRYAB、CRYBA1\A3、CRYBB1、CRYBB2、CRYGC、CRYGD)、缝隙连接蛋白基因(GJA8、GJA3)、水通道蛋白基因(MIP)、晶状体内在膜蛋白(LIM2)、细胞骨架蛋白基因(BFSF2/CP49)、转录调控因子基因(PITX3、PAX6、MAF、HSF4)、氨基葡萄糖N-乙酰转移2(GCNT2)等。上述基因的单核苷酸突变是产生遗传性白内障主要原因。临床工作中可通过基因疾病诊断与遗传咨询在数量繁多基因突变中确定致病突变。4)致病分子机制复杂。已发现先天性白内障致病基因参与晶状体及相关细胞生化过程非常复杂，如细胞骨架、离子通道、RNA剪接、内质网压力等，这使得其致病分子机制研究增加难度，也给治疗干预带来诸多障碍。目前尚缺乏晶状体变性疾病动物模型，给进一步深入系统研究该疾病带来不便。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种先天性白内障疾病动物模型的构建方法，利用该构建方法可以得到先天性白内障疾病动物模型，可用于研究者深入系统研究先天性白内障疾病，以及用于先天性白内障疾病的药物筛选。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1.一种先天性白内障疾病动物模型的构建方法，包括以下步骤：1)针对小鼠GJA8(C.134G>T)基因的第二个外显子区域设计gRNA靶标位点序列，序列如SEQIDNO.1所示；扩增同源臂和cKO区域，分别连接到载体上，最后质粒构建如图9所示；将构建好的质粒电转ES细胞，通过鉴定后再向囊胚中注射阳性克隆，并转移入小鼠体内，出生小鼠即为F0，经发育成熟后，得到发生基因突变的首建者小鼠；2)将带有突变的首建者小鼠与野生型小鼠交配，得到基因突变的杂合子小鼠F1代；3)将基因型相同的杂合子小鼠(+/-)F1代相互交配，得到GJA8(C.134G>T)基因突变纯合子小鼠(-/-)F2代。进一步，构建方法还包括步骤4)：将步骤3)的F2代小鼠与Cre工具小鼠进行杂交，从而获得F1’代GJA8(C.134G>T)mut/mut；WT/KO杂合子小鼠，将GJA8(C.134G>T)mut/mut；WT/KO杂合子小鼠进行交配，获得F2’代GJA8KO/KO纯合子非突变小鼠。进一步，步骤1)中同源臂和cKO区域包括第二外显子5’端A片段，B片段，B1片段和3’端D片段。进一步，A片段大小为3123bp，克隆A片段的引物序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；B片段大小为704bp，克隆B片段的引物序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示，B1片段大小为1234bp，克隆B1片段的引物序列如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示；D片段大小为2136bp，克隆D片段的引物序列如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示。进一步，片段分2次连接到载体上，先用NruI/AscI双酶切质粒，将A片段连接至载体；再用PmlI/NotI双酶切质粒，将B片段、B1片段和C片段融合后连接至载体。进一步，还包括对首建者小鼠CRISPR靶点位置附近片段进行测序。进一步，测序反应引物如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。进一步，得到基因突变的杂合子小鼠F1代后进行DNA测序，确认目标基因发生GJA8(C.134G>T)突变从而目标蛋白被失活。本专利技术的另一目的在于提供一种由上述构建方法得到的先天性白内障疾病动物模型。本专利技术的另一目的在于提供先天性白内障疾病动物模型在筛选治疗先天性白内障疾病药物中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种用于构建先天性白内障疾病动物模型的核酸分子。本专利技术的有益效果在于：目前转基因小鼠多采用打靶或者cas9方法进行操作，得到单一点突变或者基因功能缺失小鼠，功能较单一，费用和繁殖周期过长。在专利技术中，采用点突变与基因缺失共嵌套的模式进行载体设计及遗传小鼠构建。首先，在构建质粒过程中，在原有的2号外显子中引入c.134G>T点突变，同时，在点突变序列后设计插入loxP位点。紧接2号外显子后面加上polyA位点。原有DTA元件后及Neo筛选基因盒的两端加入SDA位点以便于与fleep工具鼠进行后期繁殖，对两侧SDA位点进行剪切。该小鼠采用CRISPR-Cas9技术进行嵌套小鼠的载体插入。得到的小鼠结果为：fleep工具小鼠配繁情况下为GJA8(c.134G>T)点突变小鼠，而与Cre工具小鼠交配后可于F1代获得GJA8(c.134G>T)点突变与CX50缺失小鼠，再进行二次繁育，使Cre工具小鼠与GJA8(c.134G>T)点突变与CX50缺失小鼠交配获得CX50条件性缺失小鼠。该小鼠既可以研究点突变造成的CX50功能紊乱也可以研究GJA8基因缺失后造成的CX50功能缺失效应。在研究中，既可以应用Cre工具小鼠进行基因缺失的研究也可以采用前房注射AAV或LV病毒进行Cre外源性引入，从而诱导晶状体局部组织区域的GJA8基因缺失，从而可以进行精细的CX50功能研究。本专利技术提供的先天性白内障疾病动物模型的构建方法，可得到表现出先天性白内障的典型特征如表现出晶状体变性混浊、晶状体上皮凋亡等特征，该动物模型可用于先天性白内障疾病的研究和筛选治疗先天性白内障疾病的药物中，其应用前景广阔。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为gRNA序列靶向GJA8(C.134G>T)基因的结构示意图；图2为设计载体的酶切位点图谱；图3为测序得到的移码突变结果图；图4为本专利技术实施例提供的GJA8(C.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种先天性白内障疾病动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)针对小鼠GJA8基因的第二个外显子区域设计gRNA靶标位点序列，序列如SEQ IDNO.1所示；扩增同源臂和cKO区域，分别连接到载体上，最后质粒构建如图9所示；将构建好的质粒电转ES细胞，通过鉴定后再向囊胚中注射阳性克隆，并转移入小鼠体内，出生小鼠即为F0，经发育成熟后，得到发生基因突变C.134G>T的首建者小鼠；/n2)将带有突变的首建者小鼠与野生型小鼠交配，得到基因突变的杂合子小鼠F1代；/n3)将基因型相同的杂合子小鼠(WT/mut)F1代相互交配，得到GJA8(C.134G>T)基因突变纯合子小鼠(mut/mut)F2代。/n

【技术特征摘要】
1.一种先天性白内障疾病动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)针对小鼠GJA8基因的第二个外显子区域设计gRNA靶标位点序列，序列如SEQIDNO.1所示；扩增同源臂和cKO区域，分别连接到载体上，最后质粒构建如图9所示；将构建好的质粒电转ES细胞，通过鉴定后再向囊胚中注射阳性克隆，并转移入小鼠体内，出生小鼠即为F0，经发育成熟后，得到发生基因突变C.134G>T的首建者小鼠；
2)将带有突变的首建者小鼠与野生型小鼠交配，得到基因突变的杂合子小鼠F1代；
3)将基因型相同的杂合子小鼠(WT/mut)F1代相互交配，得到GJA8(C.134G>T)基因突变纯合子小鼠(mut/mut)F2代。


2.根据权利要求1所述的一种先天性白内障疾病动物模型的构建方法，其特征在于，构建方法还包括步骤4)：将步骤3)的F2代小鼠与Cre工具小鼠进行杂交，从而获得F1’代GJA8(C.134G>T)mut/mut；WT/KO杂合子小鼠，将GJA8(C.134G>T)mut/mut；WT/KO杂合子小鼠进行交配，获得F2’代GJA8KO/KO纯合子非突变小鼠。


3.根据权利要求1所述的一种先天性白内障疾病动物模型的构建方法，其特征在于，步骤1)中同源臂和cKO区域包括第二外显子5’端A片段，B片段，B1片段和3’端D片段。


4.根据权利要求3所述的一种先天性白内障疾病动物模型的构建方法，其特征在于，A片段大小为3123bp...

【专利技术属性】
技术研发人员：林森，刘闻一，李雪，罗琳林，叶剑剑，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军特色医学中心，
类型：发明
国别省市：重庆;50