一种条件性mTERT过表达的小鼠模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种条件性mTERT过表达的小鼠模型的构建方法及其应用。该构建方法包括：通过无缝克隆的技术构建打靶载体，该打靶载体包含3.3kb 5'同源臂、CAG启动子、loxp‑stop‑loxp、TERT‑3XFlag‑IRES‑EGFP‑WPRE‑polyA和3.3kb 3'同源臂；将Cas9 mRNA、gRNA和上述打靶载体显微注射到野生型小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠，并鉴定出同源重组阳性F0代小鼠，回交后繁育获得F1代小鼠，即为条件性mTERT过表达的小鼠模型。本发明专利技术提供的构建方法构建的小鼠可以与不同的Cre工具鼠交配，实现在全身各种组织器官、细胞类型中的特异性过表达。该鼠可以用于研究胚胎和神经发育、衰老、创伤修复、肿瘤发生发展和治疗的多种转基因模型造模，且与CreERT工具鼠的交配可以通过他莫昔芬控制TERT过表达的时间。

【技术实现步骤摘要】
一种条件性mTERT过表达的小鼠模型的构建方法及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种条件性mTERT过表达的小鼠模型的构建方法及其应用。
技术介绍
人体多数正常分化组织内几乎无端粒酶活性，但90％以上的恶性肿瘤中都能检测到端粒酶活性，提示端粒酶在肿瘤发展的过程中具有重要作用。TERTmRNA表达水平与端粒酶活性呈正比，TERT(端粒酶逆转录酶)作为端粒酶的主要亚基之一，可以TERC(端粒酶RNA基因)为模板，通过与其他亚基的共同作用延长端粒。TERT在肿瘤中存在多种激活途径。目前已有报道的有启动子点突变、拷贝数变异、表观遗传修饰、病毒整合、基因融合或重排等。脑胶质瘤、黑色素瘤、肺癌、肝癌、甲状腺癌等多种常见恶性肿瘤均存在TERT启动子突变。此外，TCGA数据库显示，肺癌、膀胱癌、卵巢癌等多种肿瘤均有TERT扩增。TERT经典的功能为作为端粒酶的主要亚基之一，参与维持端粒长度。但近年来也有许多研究表明，TERT也具有不依赖端粒酶延长端粒功能的作用。缺少RT-domain的TERT，可通过MYC和WNT通路激活小鼠毛囊干细胞、促进上皮增殖。TERT在不依赖端粒酶活性的前提下，通过NF-κB通路激活MMP家族蛋白表达，促进肿瘤的侵袭作用。TERT可参与FOXO3a蛋白的泛素化，影响ITGB1表达水平及细胞外基质，从而影响胃癌细胞的侵袭能力。此外，TERT可通过AKT、WNT等多条通路参与细胞周期、DNA修复、炎症反应等多种细胞功能，从而影响肿瘤的生物学行为，也可通过与POLI/III的结合增强rRNA和tRNA的表达水平从而促进肿瘤增殖。但多数关于TERT对肿瘤发展的机制研究均是基于体外肿瘤细胞系，而这些细胞系多为永生化细胞系，其中很大一部分是通过不同途径激活了端粒酶的活性，从而避免了因为端粒缩短所导致的细胞衰老和死亡，在这种细胞系中，难以观察到TERT促进肿瘤细胞跨越“永生”和“恶性转化”屏障的动态作用和机制，通过体内观察TERT促进肿瘤发展的动态演变过程，有助于了解肿瘤的发展进程中的关键事件，从而为治疗提供靶点。同时体内研究肿瘤的发展过程，可同时研究肿瘤微环境的作用，包括免疫系统、血管内皮、间质细胞等在肿瘤进展中的作用，这些整体化的研究更有利于全面了解肿瘤的进展过程。既往有研究团队构建过K5-TERT小鼠，该小鼠可实现K5启动子驱动的mTERT过表达，但不能实现在K5阴性的组织中的TERT过表达，且不能控制mTERT开始过表达的时间。因此，我们构建了mTERT条件性过表达小鼠——首个条件性过表达mTERT的转基因小鼠，可以通过与不同Cre工具鼠交配得到不同组织中的MTERT过表达模型。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种条件性mTERT过表达的小鼠模型的构建方法，构建了R26-e(CAG-LSL-Tert-3XFlag-IRES-EGFP)1条件性过表达小鼠模型。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术的第一方面是提供一种条件性mTERT过表达的小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：步骤一，通过无缝克隆的技术构建打靶载体，该打靶载体包含3.3kb5'同源臂、CAG启动子、loxp-stop-loxp、TERT-3XFlag-IRES-EGFP-WPRE-polyA和3.3kb3'同源臂；步骤二，将Cas9mRNA、gRNA和上述打靶载体显微注射到野生型小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠，并鉴定出同源重组阳性F0代小鼠，回交后获得F1代小鼠，即为条件性mTERT过表达的小鼠模型。进一步地，上述gRNA的序列为(5’-3’)GGGGACACACTAAGGGAGCT(SEQIDNO.:1)。进一步地，步骤二中所述鉴定采用的技术是长片段PCR技术。进一步地，上述长片段PCR技术采用的引物序列如下：PrimerI(5’-3’)：GCCGGGCCTCGTCGTCT(SEQIDNO.:2)；PrimerII(5’-3’)：TTTTTGGGGGTGATGGTGGTC(SEQIDNO.:3)；PrimerIII(5’-3’)：CTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTAC(SEQIDNO.:4)；PrimerIV(5’-3’)：GGGATCCATTGCCACCTTTCACTT(SEQIDNO.:5)。进一步地，上述长片段PCR技术采用的反应体系包括ddH2O、PrimeStarGXLPCRBuffer、dNTP、引物和基因组DNA，其中引物的浓度为20pmol/μl。进一步地，上述长片段PCR技术的反应程序为：本专利技术的第二方面是提供上述构建方法在不同组织器官中特异性过表达mTERT中的应用，将上述构建方法构建的小鼠模型与对应的Cre小鼠交配。本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：本专利技术提供的构建方法构建的小鼠可以与不同的Cre工具鼠交配，实现在全身各种组织器官、细胞类型中的特异性过表达。该鼠可以用于研究胚胎和神经发育、衰老、创伤修复、肿瘤发生发展和治疗的多种转基因模型造模，且与CreERT工具鼠的交配可以通过他莫昔芬控制TERT过表达的时间。附图说明图1为本专利技术一实施例中构建条件性mTERT过表达的小鼠模型的策略示意图；图2为本专利技术一实施例中打靶质粒载体的图谱；图3为本专利技术一实施例中对F0代小鼠的PCR鉴定电泳图，其中maker左侧为5’同源臂鉴定结果，右侧为3’同源臂鉴定结果；图4为本专利技术一实施例中F1代小鼠的PCR鉴定电泳图；其中，图A为采用引物P1和P2扩增的结果，图B是采用引物P3和P4扩增的结果；“HE”表示杂合子，“WT”表示野生型，“M”表示marker；图5为本专利技术一实施例中条件性mTERT过表达的小鼠与TPO-CreERT2工具鼠交配得到的后代的qPCR鉴定结果；图6为本专利技术一实施例中条件性mTERT过表达的小鼠与TPO-CreERT2工具鼠交配得到的后代的IHC鉴定结果；图7为本专利技术一实施例中条件性mTERT过表达的小鼠与Alb-Cre工具鼠交配得到的后代的IHC鉴定结果，其中，图A、B分别为交配后代和条件性mTERT过表达的小鼠的结果；图8为本专利技术一实施例中条件性mTERT过表达的小鼠与BRAFCA/+；TPO-CreERT2工具鼠交配得到的后代甲状腺超声结果；图9为本专利技术一实施例中条件性mTERT过表达的小鼠与BRAFCA/+；TPO-CreERT2工具鼠交配得到的后代甲状腺的HE染色结果；图10为本专利技术一实施例中条件性mTERT过表达的小鼠与BRAFCA/+；TPO-CreERT2工具鼠交配得到的后代肺的HE染色结果，其中，图A、B分别表示不同视野中肺转移灶。具体实施方式本专利技术提供了一种条件性mTERT过表达的小鼠模型的构建方法及其应用。本专利技术提供的小鼠模型因loxp-stop-l本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种条件性mTERT过表达的小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤一，通过无缝克隆的技术构建打靶载体，所述打靶载体包含3.3kb 5'同源臂、CAG启动子、loxp-stop-loxp、TERT-3XFlag-IRES-EGFP-WPRE-polyA和3.3kb 3'同源臂；/n步骤二，将Cas9 mRNA、gRNA和所述打靶载体显微注射到野生型小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠，并鉴定出同源重组阳性F0代小鼠，回交后获得F1代小鼠，即为条件性mTERT过表达的小鼠模型。/n

【技术特征摘要】
1.一种条件性mTERT过表达的小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，通过无缝克隆的技术构建打靶载体，所述打靶载体包含3.3kb5'同源臂、CAG启动子、loxp-stop-loxp、TERT-3XFlag-IRES-EGFP-WPRE-polyA和3.3kb3'同源臂；
步骤二，将Cas9mRNA、gRNA和所述打靶载体显微注射到野生型小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠，并鉴定出同源重组阳性F0代小鼠，回交后获得F1代小鼠，即为条件性mTERT过表达的小鼠模型。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述gRNA的序列为SEQIDNO.:1。


3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤二中所述鉴定采用的技术是长片段P...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉龙，于鹏程，余发星，
申请(专利权)人：复旦大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：上海;31