乙型血友病患者来源的诱导多能干细胞的基因矫正及肝系分化方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种乙型血友病患者来源的诱导多能干细胞的基因矫正及肝系分化方法，针对乙型血友病病人的基因突变位点，利用CRISPR/Cas9系统进行定点基因矫正，筛选成功获得矫正的iPS细胞定向扩增分化为肝细胞，该细胞可在体内外表达正常的具有功能的F IX因子，实现乙型血友病的个性化基因和细胞治疗，可以大大节省治疗成本，同时避免了中和性抗体，病毒感染和血友性关节炎等相关疾病的产生。

【技术实现步骤摘要】
乙型血友病患者来源的诱导多能干细胞的基因矫正及肝系分化方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种乙型血友病患者来源的诱导多能干细胞的基因矫正及肝系分化方法及其应用。
技术介绍
乙型血友病是凝血因子IX缺乏引起的一种遗传性出血性疾病，约占全部血友病病人的15％左右。乙型血友病发病机制主要是由于FIX基因发生点突变、框架移位、缺失、插入等，导致FIX蛋白质结构或功能异常，从而出现凝血障碍。人FIX基因位于X染色体，全长3.4kb，由8个外显子和7个内含子以及侧翼序列组成。成熟的人类FIX由415个氨基酸残基组成，分子量为57000，其中约20％为糖类。在肝细胞内合成，由一个γ-羧基谷氨酸区(Gla)，两个类似表皮生长因子(EGF)区，一个激活肽(AP)区和一个催化区构成。在FIX修饰分泌过程中，会释放28个氨基酸的信号肽和18个氨基酸的前肽。当被激活的时候，FIX会在精氨酸145-丙氨酸146肽键和精氨酸180-缬氨酸181肽键2个位点先后发生裂解，释放35个氨基酸激活肽，从而形成重链-轻链结构的功能FIX。目前乙型血友病的治疗方法主要是外源凝血因子替代法，即采用新鲜冰冻血浆、血浆冷沉淀物、重组凝血因子等补充缺失的FIX。但是这种方法不仅成本高，而且可能引起中和性抗体，病毒感染和血友性关节炎等相关疾病，一定程度上又加重了患者的疾病负担。
技术实现思路
专利技术目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术提出一种制备乙型血友病患者自体诱导多能干细胞的方法，利用乙型血友病病人来源的iPS细胞(诱导性多能干细胞)，针对病人的基因突变位点，利用CRISPR/Cas9系统进行定点基因矫正，筛选成功获得矫正的iPS细胞定向扩增分化为肝细胞，该细胞可在体内外表达正常的具有功能的FIX因子，实现乙型血友病的个性化基因和细胞治疗。为实现上述目的，本专利技术提出了一种制备乙型血友病患者自体诱导多能干细胞的方法，针对乙型血友病病人的基因突变位点，利用CRISPR/Cas9系统进行定点基因矫正，筛选成功获得矫正的iPS细胞定向扩增分化为肝细胞。其中，通过如下方法检测患者的基因突变位点：对乙型血友病患者来源的iPS细胞，提取该iPS细胞基因组DNA，利用如下引物序列对外显子序列进行PCR扩增并测序：引物1：正向引物：CCACTGCCCATTCTCTTCA；反向引物：TACTTACCAACCTGCGTGCT；引物2：正向引物：CATGCCCTAAAGAGAAATTGG；反向引物：TGGGTTAGAGGGTTGGACTG；引物3：正向引物：TCAGGAAGACAGGAGCATCA反向引物:GAGGGAAACTTTGAACCATGAG；引物4：正向引物：ACCCATACATGAGTCAGTAGTTCC；反向引物：GACACAGAAAGAATTCAGGTTGTAG；引物5：正向引物：AATACTGATGGGCCTGCTTC；反向引物：ACCTGGCCTGTGTCTTGC；引物6：正向引物：GCCTATTCCTGTAACCAGCAC；反向引物：GACCCTTCTGCCTTTAGCC；引物7：正向引物：CAATTAGGTCAGTGGTCCCAAG；反向引物：GGGAAAGTGATTAGTTAGTGAGAGG；测序结果用DNAMAN软件分析，找到基因突变位置。具体地，利用CRISPR/Cas9系统进行定点基因矫正的方法为：根据测序结果，设计CRISPR/sgRNA，通过错配检测的方式在HEK293T细胞上验证sgRNA对目标位点的切割能力，选择剪切效率高的sgRNA用于后续基因矫正实验，选用PX459作为CRISPR/Cas9质粒，构建CRISPR/sgRNA载体；设计单链同源模板，通过电击转染进行基因矫正，并用嘌呤霉素(Puromycin)筛选富集阳性克隆。进一步地，所述单链同源模板中引入同义突变，且引入点在PAM(前间区序列邻近基序)结构5’端附近。一般来说，同源模板可以是单链DNA，双链DNA或者质粒形式。对于点突变细胞，采用单链DNA作为同源模板。通常单链DNA的长度为100-150nt左右，并将拟矫正的突变位点置于序列中间位置。为了达到较好的矫正效率，切割位点和矫正位点的距离要在100bp之内，最好是10bp之内。如果同源模板中包含了sgRNA和PAM序列，则有必要引进同义突变，以避免矫正后序列再次被Cas9蛋白切割。同义突变是指只改变碱基序列，不改变氨基酸序列的突变形式。最优的选择是在PAM处引入同义突变，因为PAM结构对sgRNA的识别和Cas9的切割至关重要。当不能在PAM进行同义突变时，则应该在靠近PAM的5’端处引入尽量多的同义突变位点，最好是10bp之内。具体地，成功获得矫正的iPS细胞通过如下培养方案进行肝系分化：第1天使用如下培养基进行培养：包含0.5-2％(v/v)的B27(不含维生素A)、50-70ng/ml活化素A、1-3μMCHIR99021的RPMI1640培养基；第2-3天使用如下培养基进行培养：包含50-70ng/ml活化素A的PRMI1640培养基，每日更换培养基；在第3-8天使用如下培养基进行培养：含1-3％(v/v)B27(含维生素)A、BMP410-30ng/ml、bFGF5-15ng/ml的RPMI1640培养基，每日更换培养基；在第8-13天使用如下培养基进行培养：含1-3％(v/v)的B27(含维生素A)、10-30ng/mlHGF的RPMI1640培养基，每日更换培养基；第13-18天使用如下培养基进行培养：含有0.02-0.08mg/ml转铁蛋白、0.1～0.3mg/ml胰岛素、0.02～0.06μg/ml硒酸、10-30ng/mlOSM、0.3-0.8μMDex的IMDM培养基，隔日更换培养基，其中，上述培养基均先覆盖一层Matrigel基质胶。具体地，Matrigel为提前包被在板子上，Matrigel稀释100倍(即0.18-0.22mg/mL)，按1ml/10cm2，旋动培养板，使matrigel均匀分布在孔板表面，室温孵育一小时或37度半小时。优选地，成功获得矫正的iPS细胞通过如下培养方案进行肝系分化：第1天使用如下培养基进行培养：包含1％(v/v)的B27(不含维生素A)、60ng/ml活化素A、2μMCHIR99021的RPMI1640培养基；第2-3天使用如下培养基进行培养：包含60ng/ml活化素A的PRMI1640培养基，每日更换培养基；在第3-8天使用如下培养基进行培养：含1％(v/v)B27(含维生素)A、20ng/mlBMP4、10ng/mlbFGF的RPMI1640培养基，每日更换培养基；在第8-13天使用如下培养基进行培养：含1％(v/v)的B27(含维生素A)、20ng/mlHGF的RPMI1640培养基，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乙型血友病患者来源的诱导多能干细胞的基因矫正及肝系分化方法，其特征在于，针对乙型血友病病人的基因突变位点，利用CRISPR/Cas9系统进行定点基因矫正，筛选成功获得矫正的iPS细胞定向扩增分化为肝细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种乙型血友病患者来源的诱导多能干细胞的基因矫正及肝系分化方法，其特征在于，针对乙型血友病病人的基因突变位点，利用CRISPR/Cas9系统进行定点基因矫正，筛选成功获得矫正的iPS细胞定向扩增分化为肝细胞。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过如下方法获知患者的基因突变位点：对乙型血友病患者来源的iPS细胞，提取该iPS细胞基因组DNA，利用如下引物序列对外显子序列进行PCR扩增并测序：
引物1：正向引物：CCACTGCCCATTCTCTTCA；
反向引物：TACTTACCAACCTGCGTGCT；
引物2：正向引物：CATGCCCTAAAGAGAAATTGG；
反向引物：TGGGTTAGAGGGTTGGACTG；
引物3：正向引物：TCAGGAAGACAGGAGCATCA
反向引物:GAGGGAAACTTTGAACCATGAG;
引物4：正向引物：ACCCATACATGAGTCAGTAGTTCC；
反向引物：GACACAGAAAGAATTCAGGTTGTAG；
引物5：正向引物：AATACTGATGGGCCTGCTTC；
反向引物：ACCTGGCCTGTGTCTTGC；
引物6：正向引物：GCCTATTCCTGTAACCAGCAC；
反向引物：GACCCTTCTGCCTTTAGCC；
引物7：正向引物：CAATTAGGTCAGTGGTCCCAAG；
反向引物：GGGAAAGTGATTAGTTAGTGAGAGG；
测序结果用DNAMAN软件分析，找到基因突变位置。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9系统进行定点基因矫正的方法为：根据测序结果，设计CRISPR/sgRNA，通过错配检测的方式在HEK293T细胞上验证sgRNA对目标位点的切割能力，选择剪切效率高的sgRNA用于后续基因矫正实验，选用PX459作为CRISPR/Cas9质粒，构建CRISPR/sgRNA载体；设计单链同源模板，通过电击转染进行基因矫正，并用嘌呤霉素筛选富集阳性克隆。


4.根据权利要求3所的方法，其特征在于，所述单链同源模板中引入同义突变，且引入点在前间区序列邻近基序结构5’端附近。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，成功获得矫正的iPS细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔣永平，何琼，王含璐，马钰波，程涛，
申请(专利权)人：苏州方舟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32