β属冠状病毒血清IgG抗体库、多克隆抗体库、单克隆抗体库的制备和应用制造技术

本发明专利技术公开一种β属冠状病毒血清IgG抗体库，并进一步提出了多克隆抗体杂交瘤库、单克隆抗体杂交瘤库以对应的多克隆抗体库、单克隆抗体库的制备和应用。以β

【技术实现步骤摘要】
β
属冠状病毒血清IgG抗体库、多克隆抗体库、单克隆抗体库的制备和应用


[0001]本专利技术属于生物医学领域，具体涉及β属冠状病毒血清IgG抗体库、多克隆抗体杂交瘤库、单克隆抗体杂交瘤库以对应的多克隆抗体库、单克隆抗体库的制备和应用β属冠状病毒特异性单克隆抗体杂交瘤库、单克隆抗体库的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]自2019年底开始，新冠病毒在全世界范围内暴发，在未接种疫苗的情况下，单克隆抗体可能是限制COVID
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19影响的替代途径。目前在研的中和抗体如47D11、S309、B38等均是通过与SARS
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CoV
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2S蛋白的RBD区抗原表位结合中和病毒活性，往往不能应对病毒的突变和变异。病毒的突变位点主要发生在S蛋白上，其中最近出现的omicron变体在S蛋白上有36个突变，而alpha变体有10个，gamma变体有12个，delta变体有9个。随着新冠病毒的流行和发展，逐渐出现了Delta、Omicron等多种突变体，许多在研的中和抗体对突变体无法发挥中和抑制效应，新冠病毒突变体的感染风险也呈上升趋势。新冠病毒与非典型性肺炎病毒(SARS
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CoV)和中东呼吸综合征病毒(MERS
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CoV)同属β属
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冠状病毒，能够引起极为严重的呼吸系统综合征。目前，针对新冠病毒肺炎的防治药物匮乏，尤其缺乏对于新冠及其多种突变体的通用性中和治疗抗体，先前对于感染人类的SARS
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CoV及MERS
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CoV也尚无特效防治药物上市。根据现有统计数据，现已报道新冠病毒序列近七百万余条，存在六十余万个基因组突变。寻找应对多种冠状病毒的通用防治药物迫在眉睫。
[0003]此外，未来仍存在爆发其他新型冠状病毒的风险，研发针对此类冠状病毒(包括正流行的新冠病毒)的通用性中和抗体库迫在眉睫。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术通过研究针对恒定保守区域的多克隆杂交瘤抗体库及单克隆杂交瘤抗体库，同时，将恒定保守区域与受体结合区域结合进行融合蛋白表达载体构建与表达，免疫动物制备相应的血清IgG综合抗体。基于此筛选的中和抗体能大规模生产、效价高，不仅能为当前流行的新冠肺炎提供中和抗体，还将同时创建阻断多种冠状病毒及其突变体感染的通用(共同)中和抗体库，为今后潜在突发冠状病毒变体和新发冠状病毒感染提供及时的中和抗体治疗手段。
[0005]为实现上述目的，本专利技术首先提出一种β属冠状病毒血清IgG抗体库，包括如下血清IgG抗体库中的任意一种或几种的组合：
[0006]分别以新冠病毒COVID
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19S蛋白的6个重组蛋白片段个作为抗原免疫小鼠，获得抗血清，进一步将抗血清纯化后得到对应于每个重组蛋白片段的血清IgG抗体库，其中，所述6个重组蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1
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SEQ ID NO.6所示。
[0007]具体地，免疫方法为：将所述6个重组蛋白片段溶液与等量的弗氏完全佐剂混匀，分别腹腔注射和肌肉注射，进行初次免疫，两周后，改用弗氏不完全佐剂用相同的方法对同
样的部位进行注射，进行强化免疫，强化免疫两周后，使用所述6个重组蛋白片段溶液尾静脉注射进行冲击免疫。
[0008]在具体的实施方式中，血清IgG抗体纯化的方法为：取5mL Prism A Agarose悬液(GE)装柱，用50mL含少量叠氮化钠的PBS平衡柱子。将样品上柱。用10
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20个柱体积的PBS洗涤去除杂蛋白，同时用蛋白染液检测流出液，当流出液中不含有蛋白时，加入适量0.05mol甘氨酸(Glycine,pH 3.0)进行洗脱。分管收集洗脱液至流出液无蛋白检出，在收集管中加入适量20mM Tris溶液，将洗脱液中和至pH7.0左右。对收集到的洗脱液用蛋白染液测定蛋白含量，之后通过SDS
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PAGE进行成分鉴定，确认后过滤除菌分装保存于
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80℃冰箱，建立血清IgG综合抗体库。
[0009]通过ELISA检测综合抗体IgG与各S蛋白片段的结合能力，其中一蛋白片段“COVID19
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SF5”(SEQ ID NO.5)的抗体与每个S蛋白片段均存在一定的交叉反应性，且结合能力较高。并且此抗体在首次免疫免疫3个月后仍与所有蛋白均有明显的交叉反应，在免疫6个月后尽管交叉反应能力减弱，但抗血清与大部分蛋白仍存在明显反应。提示COVID19
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SF5蛋白片段免疫的抗血清为多种β
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属冠状病毒通用的血清IgG综合抗体。
[0010]本专利技术进一步提出一种β属冠状病毒特异性单克隆抗体杂交瘤库的制备方法，包括如下步骤：
[0011](1)以COVID19
‑
SF5蛋白片段作为抗原免疫小鼠，获取免疫后小鼠的脾细胞，将所述脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，得到杂交瘤细胞，其中，所述蛋白片段COVID19
‑
SF5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0012](2)挑选阳性克隆，通过多次传代和ELISA验证，反复筛选，最终确认稳定分泌抗体的细胞株为多克隆抗体杂交瘤细胞株，冻存所述多克隆抗体杂交瘤细胞株构建多克隆抗体杂交瘤库。
[0013]其中，步骤(1)中，先用COVID19
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SF5蛋白溶液与等量的弗氏完全佐剂混匀，分别腹腔注射和肌肉注射，进行初次免疫，两周后，改用弗氏不完全佐剂用相同的方法对同样的部位进行注射，进行强化免疫，最后在进行融合实验前72小时，使用COVID19
‑
SF5蛋白溶液尾静脉注射进行冲击免疫。
[0014]步骤(2)中，挑选阳性克隆的步骤为：在细胞融合实验完成7～9天后，显微镜下观察96孔板，若其中存在成团、个体较大、细胞状态透明发亮的则可能为杂交瘤细胞，将含有这类细胞的孔迅速做好标记，取细胞培养液上清做ELISA，阳性孔的判断条件是其OD值比阴性对照孔大0.1或OD
测试孔
与OD
阴性孔
比值不小于2.1；观察阳性孔中细胞生长状况，若细胞数量多、生长状况良好，则扩大培养；若细胞数量较少，则可先将阳性孔中细胞按1：2传代到新的96孔中培养，待细胞数量足够后再合并转移至24孔板中扩大培养；细胞扩大培养后需再次进行ELISA以确认仍为阳性，同时进一步对细胞传代，再次扩大培养，通过多次传代和ELISA验证，反复筛选，最终确认稳定分泌抗体的细胞株为多克隆抗体杂交瘤细胞株，冻存上述多克隆抗体杂交瘤细胞株构建多克隆抗体杂交瘤库。
[0015]本专利技术还提出了基于上述多克隆抗体杂交瘤库得到的β属冠状病毒多克隆抗体库，通过将上述得到的多克隆抗体杂交瘤库中的多克隆抗体杂交瘤细胞接种入小鼠，产生腹水，制备对应的多克隆抗体，得到多克隆抗体库。
[0016]基于上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β属冠状病毒血清IgG抗体库，其特征在于，包括如下血清IgG抗体库中的任意一种或几种的组合：分别以新冠病毒COVID
‑
19 S蛋白的6个重组蛋白片段个作为抗原免疫小鼠，获得抗血清，进一步将抗血清纯化后得到对应于每个重组蛋白片段的血清IgG抗体库，其中，所述6个重组蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1
‑ꢀ
SEQ ID NO.6所示。2.根据权利要求1所述的血清IgG抗体库，其特征在于，免疫方法为：分别将所述6个重组蛋白片段溶液与等量的弗氏完全佐剂混匀，分别腹腔注射和肌肉注射，进行初次免疫，两周后，改用弗氏不完全佐剂用相同的方法对同样的部位进行注射，进行强化免疫，强化免疫两周后，分别使用所述6个重组蛋白片段溶液尾静脉注射进行冲击免疫。3.一种β属冠状病毒多克隆抗体杂交瘤库的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）以COVID19
‑
SF5蛋白片段作为抗原免疫小鼠， 获取免疫后小鼠的脾细胞，将所述脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，得到杂交瘤细胞，其中，所述蛋白片段COVID19
‑
SF5的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；（2）挑选阳性克隆，通过多次传代和ELISA验证，反复筛选，最终确认稳定分泌抗体的细胞株为多克隆抗体杂交瘤细胞株，冻存所述多克隆抗体杂交瘤细胞株构建多克隆抗体杂交瘤库。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，先用COVID19
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SF5蛋白溶液与等量的弗氏完全佐剂混匀，分别腹腔注射和肌肉注射，进行初次免疫，两周后，改用弗氏不完全佐剂用相同的方法对同样的部位进行注射，进行强化免疫，最后在进行融合实验前72小时，使用COVID19
‑
SF5蛋白溶液尾静脉注射进行冲击免疫。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，挑选阳性克隆的步骤为：在细胞融合实验完成7～9天后，显微镜下观察96孔板，若其中存在成团、个体较大、细胞状态透明发亮的则可能为杂交瘤细胞，将含有这类细胞的孔迅速做好标记，取细胞培养液上清做ELISA，阳性孔的判断条件是其OD值比阴性对照孔大0.1或...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋永平，王含璐，蒋文宏，
申请(专利权)人：苏州方舟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：