一种RA16-A与DNA四面体载体共聚物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开一种RA16

【技术实现步骤摘要】
一种RA16
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A与DNA四面体载体共聚物及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物纳米医药领域，具体涉及一种靶向递送体系，更具体地，本专利技术涉及一种RA16
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A与DNA四面体载体共聚物及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]肺癌是全世界癌症死亡的最常见原因。非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌病例的 85％
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90％。传统的癌症疗法(如化疗和放疗)会出现严重的副作用，包括胃肠道不适、器官损伤并且严重影响生活质量。
[0003]目前针对非小细胞肺癌的新疗法，在过去的几十年中，表皮生长因子受体(EGFR) 酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)最常用于肺癌治疗。这些抑制剂用于含有EGFR突变的晚期非小细胞肺癌患者与化疗相比大大降低了周身毒性，显著提高了病人生存率，因此靶向治疗十分必要。
[0004]适配体是一类单链的寡核苷酸片段(DNA或RNA)，在生物环境中能够折叠成特定的空间结构，通过空间互补、静电作用、范德华力、氢键等作用，可与特定的靶标高度亲和的结合。由于适配体具有与靶物质结合的特异性，与抗体相比，其分子量更小，易于合成，又无免疫原性；与同为核酸的小干扰RNA(siRNA)等相比，其作用形式和作用范围更为多样，因此，适配体非常具有开发为特异性的与靶组织结合的靶向诊断或靶向治疗制剂的价值。同时，适配体分子量小、易于通过化学合成，便于储存和运输，无论和抗体还是同为核酸的小核酸比，都有一定的优势，因此，适配体被广泛应用于体外诊断、体内成像和靶向制剂的开发中。截至目前，RNA适配体药物在一些疾病的诊断和治疗领域已取得了不错的成效。FDA已批准了Eyetch/Pfizer开发的针对VEGF的核酸适配体——pegaptanib(商品名Macugen)用于治疗年龄相关性黄斑病症。
[0005]在此前的研究中，我们研发团队报道了首例利用聚乙二醇(PEG)修饰的RNA文库，直接在人非小细胞肺癌荷瘤裸鼠体内开展的活体SELEX技术，富集到对于人非小细胞肺癌具有靶向及抑瘤双特异功能的RNA适配体RA16(CN201610168486.9)。该技术不仅有效降低了以往在体外筛选过程中筛选文库与高丰度非靶蛋白的非特异性结合，提高了与原位组织特异性结合靶序列的筛选概率和针对性，而且，由于在筛选的过程中引入了PEG修饰，筛选到的RNA适配体更容易进行各种修饰和偶联，而不易在修饰过程中丧失其生物学特性，具有极大的后期开发潜力。然而，尽管我们已对 RA16进行了部分修饰，增强了其组织稳定性和半衰期，由于RNA自身易降解、易清除的特性，我们仍需继续探索并进一步提高其稳定性、载药能力及生物相容性，进一步开发更适用于临床的纳米级靶向药物递送系统。
[0006]尽管目前已经通过SELEX技术筛选出了不少核酸适配体，然而真正进入临床诊断和靶向治疗的核酸适配体却屈指可数，不少大量费时费力筛选出的核酸适配体由于稳定性差等因素并不能真正应用到临床诊断与治疗工作中去。因此利用药物递送系统增加体内循环的半衰期，增加药物稳定性成为一种可实现的方法，而与合成材料相比，来源于内源性材料的载体优越的生物相容性在纳米医学的发展中非常有利。因此利用具有纳米级尺寸、高
载药能力、生物相容性，粘附适体分子后拥有靶标识别高亲和力，并且具有良好的细胞内化效率的DNA纳米材料作为载体具有很大的发展前景。

技术实现思路

[0007]专利技术目的：鉴于现有技术中存在的上述问题，本专利技术的主要目的在于解决现有技术的缺陷，本专利技术提供一种RA16
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A与DNA四面体载体共聚物，其为靶向抑瘤双特异性适配体纳米药物，该体系是利用DNA四面体结构作为DNA载体，它是拥有固定空间结构的最小DNA纳米载体单元，成功装载了通过活体筛选获得的靶向及抑制人非小细胞型肺癌的双特异性适配体RA16。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了一种RA16
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A与DNA四面体载体共聚物，所述 RA16
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A为在RA16 3
’
端添加20个poly A，DNA四面体载体的四条单链DNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1
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4所示，其中，所述四条单链DNA中的任意一条在3
’
端添加20个poly T，RA16
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A与DNA四面体载体的摩尔比为1:1。
[0009]在本专利技术的一个具体实施例中，通过在SEQ ID NO：4的核苷酸序列的3
’
端添加 20个poly T，已实现与RA16的互补。
[0010]优选地，所述四条单链DNA和RA16
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A中的任意一个在共聚前先进行荧光标记。
[0011]所述荧光标记为FITC、Alexa 488、Cy3、Cy5和Cy7中的任意一种。在具体实施时，直接使用标记的核苷酸链参与退火，通过自组装获得荧光标记的共聚物。
[0012]本专利技术进一步提出了上述RA16
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A与DNA四面体载体共聚物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0013](1)RA16
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A的合成：通过PCR合成相应的模板链DA16
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T，然后经体外转录得到；
[0014](2)DNA纳米载体对RA16
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A的负载：利用PCR程序升温后退火将两两互补的四条单链DNA与RA16
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A通过碱基互补完成负载，得到RA16
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A与DNA四面体载体共聚物，其中，四条单链DNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1
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4所示。
[0015]其中，退火程序为：80～95℃10～20min，4℃30～40min。
[0016]本专利技术进一步提出了所述RA16
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A与DNA四面体载体共聚物在制备靶向非小细胞型肺癌的诊断试剂中的应用。
[0017]本专利技术还提出了RA16
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A与DNA四面体载体共聚物在制备用于抑制非小细胞型肺癌的药物中的应用。
[0018]在另一方面，本专利技术提出了上述RA16
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A与DNA四面体载体共聚物在生物检测、活体成像、基因载体、药物传递中的应用。
[0019]更进一步地，本专利技术提出了一种靶向非小细胞型肺癌的药物，其为上述共聚物与非小细胞型肺癌的化疗药物、siRNA或单克隆抗体中的任意一种的复合物。
[0020]有益效果：本专利技术主要解决了双特异性RNA适配体RA16在体内循环时间短、易降解的问题，利用DNA纳米结构负载的RA16可以显著提高RA16在细胞、体内靶组织的循环时间，提高RA16在细胞或肿瘤组织中的富集度和存活时间，成功实现了RA16在肿瘤区域的长富集，可作为肿瘤诊断试剂用于活体成像。此外，该核酸适配体本身可以抑制肿瘤细胞生长，通过与DNA四面体偶联，可进一步装载肺癌化疗药物、siRNA、单克隆抗体等，实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RA16
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A与DNA四面体载体共聚物，其特征在于，所述RA16
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A为在RA16 3
’
端添加20个poly A，DNA四面体载体的四条单链DNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1
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4所示，其中，所述四条单链DNA中的任意一条在3
’
端添加20个poly T，RA16
‑
A与DNA四面体载体的摩尔比为1:1。2.根据权利要求1所述的RA16
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A与DNA四面体载体共聚物，其特征在于，所述四条单链DNA和RA16
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A中的任意一个在共聚前先进行荧光标记。3.根据权利要求2所述的RA16
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A与DNA四面体载体共聚物，其特征在于，所述荧光标记为FITC、Alexa 488、Cy3、Cy5和Cy7中的任意一种。4.权利要求1所述的RA16
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A与DNA四面体载体共聚物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）RA16
‑
A的合成：通过PCR合成相应的模板链DA1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王含璐，秦蒙，苏昕，蒋永平，
申请(专利权)人：苏州方舟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：