产左旋海松二烯和左旋海松酸的重组酿酒酵母及构建方法技术

本发明专利技术公开了产左旋海松二烯和左旋海松酸的重组酿酒酵母及构建方法，步骤为：向酿酒酵母中导入改造的左旋海松二烯合酶编码基因TΔLPS、优化的细胞色素P450酶编码基因CYP720B1和优化的细胞色素P450还原酶编码基因TcCPR，得到重组菌1；向重组菌1中导入3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1，得到重组菌2；向重组菌2中导入法呢基焦磷酸合酶编码基因Erg20，得到重组菌3；将重组菌3中野生型鲨烯合酶启动子替换成Met3启动子，得到重组菌4；实验证明，本发明专利技术的重组菌发酵可以提高左旋海松二烯和左旋海松酸的产量；为人工细胞合成左旋海松二烯和左旋海松酸奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
产左旋海松二烯和左旋海松酸的重组酿酒酵母及构建方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种产左旋海松二烯和左旋海松酸的重组酿酒酵母及构建方法。
技术介绍
左旋海松二烯(levopimaradiene)是合成银杏内酯的前提物质，银杏内酯具有抗血小板凝集、抗炎症、抗血栓等药理作用。左旋海松酸(levopimaricacid)是一种重要的松香树脂酸，左旋海松酸具有同环共轭双键结构，在常温下能与马来酸酐发生Diels-Alder加成反应，生成马来海松酸，广泛应用于涂料，印染、油墨等行业，可以作为增塑剂。马来海松酸的酰胺和亚酰胺具有抗兽类肝炎的作用，同时它的衍生物具有抗炎症、抗溃疡作用。左旋海松酸与2-(2,4-二氧-5-噻唑烷二酮)乙酸合成一种左旋海松酸衍生物，其具有抗癌症、抗菌、抗痨、抗HIV作用。左旋海松酸的制备现在主要是以松脂为原材料，从中分离出左旋海松酸，分离工艺比较复杂。左旋海松酸属于二萜类化合物，在烯丙基焦磷酸(DMAPP)的基础上，逐步叠加3个异戊烯基焦磷酸(IPP)，生成前体化合物GGPP(C20)。2001年Schepmann等人在银杏幼苗根部所构建的cDNA文库中克隆并鉴定了左旋海松二烯合酶LPS，LPS催化GGPP环化形成85％的左旋海松二烯，15％的副产物abietadiene，及微量的neo-abietadiene和palustradiene。催化原理为，GGPP在LPS的催化下首先生成C8-sandaracopimarenyl阳离子中间体，通过氢重排，进一步形成C15-sandaracopimarenyl阳离子中间体。然后13位上的甲基转移到15位上生成abietenyl阳离子中间体，最后通过不同的氢重排和去质子化作用，分别形成abietadiene，levopimaradiene，palustradiene和neo-abietadiene。2010年Leonard等在大肠杆菌中表达LPS基因，最终在生物反应器中发酵得到了约700mg/L的左旋海松二烯(levopimaradiene)。原始的左旋海松二烯合酶LPS的酶活很低，需要进行改造才能提高左旋海松二烯的产量。细胞色素P450酶的CYP720B亚家族在二萜松脂酸的生物合成中扮演着重要的作用，CYP720B亚家族中的两种P450酶，来源Loblollypine的CYP720B1以及来源Sitkaspruce的CYP720B4已经经过鉴定，可以三步氧化左旋海松二烯，依次形成醇、醛中间体，最后生成左旋海松酸。目前未见在酿酒酵母中异源合成左旋海松二烯和左旋海松酸的报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是克服现有技术的不足，提供一种产左旋海松二烯和左旋海松酸的重组酿酒酵母的构建方法。本专利技术的第二个目的是提供一种产左旋海松二烯和左旋海松酸的重组酿酒酵母。本专利技术的技术方案概述如下：一种产左旋海松二烯和左旋海松酸的重组酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤：(1)向酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeW303-1a)中导入改造的左旋海松二烯合酶编码基因TΔLPS、优化的细胞色素P450酶编码基因CYP720B1和优化的细胞色素P450还原酶编码基因TcCPR，得到重组菌1；所述改造的左旋海松二烯合酶编码基因TΔLPS是左旋海松二烯合酶编码基因LPS编码的氨基酸序列的N端截短79个氨基酸并且左旋海松二烯合酶编码基因LPS编码的氨基酸序列的第593的甲硫氨酸密码子突变为异亮氨酸密码子以及第700的酪氨酸的密码子突变为苯丙氨酸密码子；所述改造的左旋海松二烯合酶编码基因TΔLPS的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述优化的细胞色素P450酶编码基因CYP720B1的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述优化的细胞色素P450还原酶编码基因TcCPR的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；(2)向重组菌1中导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1，得到重组菌2；所述3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。(3)向重组菌2中导入法呢基焦磷酸合酶编码基因Erg20，得到重组菌3；所述法呢基焦磷酸合酶编码基因Erg20的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；(4)将重组菌3中野生型鲨烯合酶启动子替换成Met3启动子，得到重组菌4；所述Met3启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。上述方法制备的产左旋海松二烯和左旋海松酸的重组酿酒酵母菌。实验证明，本专利技术的重组菌发酵可以提高左旋海松二烯和左旋海松酸的产量；本专利技术成功构建的产左旋海松二烯和左旋海松酸的重组酿酒酵母菌株，为人工细胞合成左旋海松二烯和左旋海松酸奠定了基础。具体实施方式酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W303-1a，美国ATCC208352购买时间，2016.6网址：https://www.atcc.org/下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、各片段来源及质粒制备方法(1)本专利技术所用的基因原件LPS序列(levopimaradienesynthaseLPS，GenPept:Q947C4.1)来源于植物银杏(Ginkgobiloba)；CYP720B1序列(cytochromeP450)来源于火炬松(Loblollypine)、TcCPR序列(plantP450sdependoncytochromeP450reductaseCPR)来源于植物东北红豆杉(Taxuscuspidate)，由武汉金开瑞生物工程有限公司通过化学合成的方法合成，并针对酿酒酵母进行密码子优化，并连接在大肠杆菌质粒上，保存在大肠杆菌中。得到优化的细胞色素P450酶编码基因CYP720B1的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示和优化的细胞色素P450还原酶编码基因TcCPR的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。(2)将编码左旋海松二烯合酶的基因LPS，改造成截短突变的TΔLPS的方法如下：TΔLPS(左旋海松二烯合酶编码基因LPS编码的氨基酸序列的N端截短79个氨基酸，左旋海松二烯合酶编码基因LPS编码的氨基酸序列的第593的甲硫氨酸密码子突变为异亮氨酸密码子、第700的酪氨酸的密码子突变为苯丙氨酸密码子)，将5’端237个碱基切除，并在5’端加上起始密码子ATG，然后将LPS的第1777-1779bp碱基由ATG突变成ATC，将LPS的第2098-2100bp碱基由TAT突变成TTC，得到改造后的碱基序列TΔLPS。所述LPS序列在NCBI中可查(GenPept:Q947C4.1)，改造的左旋海松二烯合酶编码基因TΔLPS序列如SEQIDNO.1所示。用表1描述的引物进行PCR。以pUC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产左旋海松二烯和左旋海松酸的重组酿酒酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：/n(1)向酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeW303-1a)中导入改造的左旋海松二烯合酶编码基因TΔLPS、优化的细胞色素P450酶编码基因CYP720B1和优化的细胞色素P450还原酶编码基因TcCPR，得到重组菌1；/n所述改造的左旋海松二烯合酶编码基因TΔLPS是左旋海松二烯合酶编码基因LPS编码的氨基酸序列的N端截短79个氨基酸并且左旋海松二烯合酶编码基因LPS编码的氨基酸序列的第593的甲硫氨酸密码子突变为异亮氨酸密码子以及第700的酪氨酸的密码子突变为苯丙氨酸密码子；所述改造的左旋海松二烯合酶编码基因TΔLPS的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述优化的细胞色素P450酶编码基因CYP720B1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述优化的细胞色素P450还原酶编码基因TcCPR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；/n(2)向重组菌1中导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1，得到重组菌2；/n所述3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。/n(3)向重组菌2中导入法呢基焦磷酸合酶编码基因Erg20，得到重组菌3；/n所述法呢基焦磷酸合酶编码基因Erg20的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；/n(4)将重组菌3中野生型鲨烯合酶启动子替换成Met3启动子，得到重组菌4；/n所述Met3启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。/n...

【技术特征摘要】
1.一种产左旋海松二烯和左旋海松酸的重组酿酒酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)向酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeW303-1a)中导入改造的左旋海松二烯合酶编码基因TΔLPS、优化的细胞色素P450酶编码基因CYP720B1和优化的细胞色素P450还原酶编码基因TcCPR，得到重组菌1；
所述改造的左旋海松二烯合酶编码基因TΔLPS是左旋海松二烯合酶编码基因LPS编码的氨基酸序列的N端截短79个氨基酸并且左旋海松二烯合酶编码基因LPS编码的氨基酸序列的第593的甲硫氨酸密码子突变为异亮氨酸密码子以及第700的酪氨酸的密码子突变为苯丙氨酸密码子；所述改造的左旋海松二烯合酶编码基因TΔLPS的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述优化的细胞色素P450酶编码基因CYP720B1...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢文玉，张传波，刘婷，鞠海燕，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12