一种多片段DNA组装试剂盒、多片段DNA组装方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种多片段DNA组装试剂盒、多片段DNA组装方法及其应用，所述试剂盒包括待组装的DNA片段F

【技术实现步骤摘要】
一种多片段DNA组装试剂盒、多片段DNA组装方法及其应用
本专利技术属于合成生物学
，涉及一种多片段DNA组装试剂盒、多片段DNA组装方法及其应用，尤其涉及一种多片段DNA组装试剂盒、多片段DNA组装方法及其在构建大片段重组质粒中的应用。
技术介绍
近年来合成生物学迅速发展，在生物医药、能源和新材料等领域得到广泛的应用。超大质粒可以服务于大型代谢通路研究、染色体研究和基因组研究等，有助于进行基因功能、代谢通路功能研究和认识生命。但是，超大质粒的合成存在诸多困难，科学家们虽然提出了多种方法用于超大质粒的合成，但是普遍存在效率低下的问题。这就需要在超大质粒的合成和拼装技术上进行改进和突破。现阶段，体外大片段组装方法包括Gateway、In-fusion、Cold-fusion、T4DNApolymerase-basedLigaseIndependentCloning(LIC)、GoldenGate和GibsonAssembly等。其中，Gateway技术需要构建入门载体，耗时较长，成本较高；GoldenGate技术依赖于II型限制性内切酶和连接酶，不适用于存在上述酶的序列的合成，需要提前分析片段序列再进行组装；而传统的Gibson组装技术在进行多片段组装时效率较低，尤其是对于片段较大的片段，组装成功率很低。因此，需要提出新的高效的超大质粒组装方法。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种多片段DNA组装试剂盒、多片段DNA组装方法及其应用，所述试剂盒将体外组装和体内组装相结合，显著提高了多片段DNA组装效率，提高了超大质粒的合成成功率。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种多片段DNA组装试剂盒，所述试剂盒包括待组装的DNA片段Fn和载体；所述载体包括中间连接载体和/或组装载体；所述DNA片段F1的上游和DNA片段Fn的下游包含中间连接载体的同源臂，即与中间连接载体的两端具有相同的重叠序列；所述DNA片段Fi的上游与DNA片段Fi-1的下游具有一段重叠的反向互补序列，所述DNA片段Fi的下游与DNA片段Fi+1的上游具有一段重叠的反向互补序列；其中，n≥2且为偶数，1≤i≤n；当i为奇数时，所述片段Fi为正向序列，当i为偶数时，所述片段Fi为反向互补序列；所述试剂盒还包括酿酒酵母菌。本专利技术中，所述试剂盒采用体外组装和体内组装相结合的方式，首先采用重组酶体系将大片段DNA与组装载体在体外进行组装，再将体外组装产物转化入酿酒酵母菌进行体内组装，所述试剂盒结合了体外组装和体内组装的优点，解决了单纯采用体外组装或体内组装构建超大质粒成功率低的问题。本专利技术中，在进行多片段DNA组装的过程中，首先采用一系列较短的DNA片段Fn构建初始片段，依赖不同的DNA片段Fn间的一段重叠的反向互补序列，采用PCR构建得到长度较大的初始片段，再依赖初始片段构建大片段DNA。本专利技术中，组装载体为有利于构建大片段DNA的载体，例如可以是Yac0和/或Yac1。优选地，所述DNA片段Fn的长度为50～75bp，例如可以是50bp、51bp、52bp、53bp、54bp、55bp、56bp、57bp、58bp、59bp、60bp、61bp、62bp、63bp、64bp、65bp、66bp、67bp、68bp、69bp、70bp、71bp、72bp、73bp、74bp或75bp，优选为60～65bp。优选地，所述重叠的反向互补序列的长度为18～30bp，例如可以是18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp或30bp，优选为20～25bp。优选地，所述中间连接载体包括PUC57-Amp。优选地，所述试剂盒还包括限制性内切酶、DNA外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶或重组酶中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述限制性内切酶包括EcoRV。优选地，所述DNA外切酶包括T5DNA外切酶。优选地，所述DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶。优选地，所述DNA连接酶包括T4DNA连接酶。优选地，所述重组酶包括T5核酸外切酶和高保真Taq酶的混合酶。优选地，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、重组缓冲液、酶切缓冲液或连接缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。第二方面，本专利技术提供了一种多片段DNA组装方法，所述方法采用如第一方面所述的试剂盒进行多片段DNA组装。优选地，所述方法包括以下步骤：(1)利用PCR将待组装的DNA片段Fn进行拼接，得到拼接产物；(2)将步骤(1)获得的拼接产物与线性化的中间载体进行重组反应，或将步骤(1)获得的平末端拼接产物平连入EcoRV酶切后的线性化的平末端中间连接载体中；(3)将步骤(2)获得的连接产物采用DNA片段F1和DNA片段Fn作为引物进行PCR扩增，得到用于构建大片段DNA的初始片段；(4)将步骤(3)获得的初始片段与线性化的组装载体进行体外组装；(5)将步骤(4)获得的体外组装产物导入酿酒酵母菌感受态细胞，进行体内组装。本专利技术中，多片段DNA组装采用体外组装和体内组装相结合的方式，首先采用重组酶体系将大片段DNA与组装载体在体外进行组装，再将体外组装产物转化入酿酒酵母菌进行体内组装，所述方法结合了体外组装和体内组装的优点，解决了单纯采用体外组装或体内组装构建超大质粒成功率低的问题。优选地，步骤(1)所述PCR的条件为96～98℃预变性2～3min；96～98℃变性10～30s，58～60℃退火30～50s，70～72℃延伸1～2min，30～35个循环；70～72℃延伸5～8min；0～4℃保存。优选地，在步骤(1)后还包括对拼接产物再次进行PCR扩增的过程。本专利技术中，如果上一轮PCR扩增的效果不理想，可以以上一轮PCR的产物为模板，以同样的方法进行下一轮PCR，直到扩增出理想的条带。优选地，步骤(2)所述限制性内切酶包括EcoRV。优选地，步骤(2)所述中间连接载体包括PUC57-Amp。优选地，步骤(3)所述初始片段的上游和/或下游包含同源臂。本专利技术中，在进行多片段DNA组装的过程中，首先采用一系列较短的DNA片段Fn构建初始片段Ln(2≤n≤20)，其中，初始片段L1的上游和初始片段Ln的下游包含组装载体的同源臂，初始片段Li(2≤i≤n)的上游与初始片段Li-1的下游具有相同的重叠序列，初始片段Li的下游与初始片段Li+1的上游具有相同的重叠序列，再利用重组酶体系将具有相同的重叠序列的初始片段进行体外组装。优选地，所述同源臂的长度为40～80bp，例如可以是40bp、45bp、50bp、55bp、60bp、65bp、70bp、75bp或80bp，优选为60bp。优选地，所述重叠序列的长度为40本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多片段DNA组装试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括待组装的DNA片段F

【技术特征摘要】
1.一种多片段DNA组装试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括待组装的DNA片段Fn和载体；
所述载体包括中间连接载体和/或组装载体；
所述DNA片段F1的上游和DNA片段Fn的下游包含中间连接载体的同源臂，所述DNA片段Fi的上游与DNA片段Fi-1的下游具有一段重叠的反向互补序列，所述DNA片段Fi的下游与DNA片段Fi+1的上游具有一段重叠的反向互补序列；
其中，n≥2且为偶数，1≤i≤n；
当i为奇数时，所述片段Fi为正向序列，当i为偶数时，所述片段Fi为反向互补序列；
所述试剂盒还包括酿酒酵母菌。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA片段Fn的长度为50～75bp，优选为60～65bp；
优选地，所述重叠的反向互补序列的长度为18～30bp，优选为20～25bp；
优选地，所述中间连接载体包括PUC57-Amp。


3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括限制性内切酶、DNA外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶或重组酶中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述限制性内切酶包括EcoRV；
优选地，所述DNA外切酶包括T5DNA外切酶；
优选地，所述DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶；
优选地，所述DNA连接酶包括T4DNA连接酶；
优选地，所述重组酶包括T5核酸外切酶和高保真Taq酶。


4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、重组缓冲液、酶切缓冲液或连接缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。


5.一种多片段DNA组装方法，其特征在于，所述方法采用如权利要求1-4任一项所述的试剂盒进行多片段DNA组装。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)利用PCR将待组装的DNA片段Fn进行拼接，得到拼接产物；
(2)将步骤(1)获得的拼接产物与线性化的中间连接载体进行重组反应，或将步骤(1)获得的平末端拼接产物平连入...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱佑民，杨平，孙健，柳伟强，刘敏祥，严成丽，邢妍婧，赵一凡，
申请(专利权)人：苏州泓迅生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32