一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法技术

本发明专利技术涉及通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中

A method of co expression of hemoglobin to increase the expression of \u03b1 - galactosidase induced by methanol in Pichia pastoris

【技术实现步骤摘要】
一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法
本专利技术涉及化工，特别是一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法。
技术介绍
α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.12)能够将α-半乳寡糖、半乳甘露聚糖侧链、半乳糖脂和糖蛋白通过α-半乳糖苷键连接的非还原端的半乳糖苷残基逐个水解掉。α-半乳糖苷酶在食品、饲料等工业中有着广泛的应用。在制糖工业中，α-半乳糖苷酶可以分解甜菜浆中的棉籽糖来提高蔗糖的回收率。在饲料工业中，α-半乳糖苷酶可以分解饲料中的棉籽糖家族寡糖类抗营养物质，减少其在单胃动物饲喂中引起的腹胀和腹泻问题，同时又能提高饲料的利用率。在造纸工业中，α-半乳糖苷酶还可以用来提高甘露聚糖酶对纸浆的漂白效果。所以α-半乳糖苷酶有着广阔的市场前景。在生产方面，利用基因工程的手段构建高效的表达菌株是现在α-半乳糖苷酶生产的主要途径，毕赤酵母就是一种最常用的工程菌株，为了提高毕赤酵母工程菌株中α-半乳糖苷酶的表达量，通过在甲醇诱导型分泌表达α-半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌株中共表达透明颤菌血红蛋白的方法来提高毕赤酵母工程菌株发酵液中α-半乳糖苷酶的表达量，具有显著的提高效果，相对于出发菌株，共表达透明颤菌的血红蛋白将α-半乳糖苷酶的表达量提高，但至今未见有公开报导。
技术实现思路
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法，可有效解决提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量及其应用的问题。本专利技术解决的技术方案是，一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法，包括以下步骤：（1）、构建表达质粒pPIC9K-Gal1：用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对α-半乳糖苷酶基因Gal1和毕赤酵母甲醇诱导型表达载体pPIC9K同时进行双酶切，之后用T4DNA连接酶将α-半乳糖苷酶基因连接进载体pPIC9K中，形成表达质粒pPIC9K-Gal1；所述α-半乳糖苷酶基因为在密码子、mRNA二级结构和GC含量方面进行优化后的米根毛霉（Rhizomucormiehei）来源的一个α-半乳糖苷酶基因；（2）、构建甲醇诱导型表达α-半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌出发菌株：按照Invitrogen公司的酵母转化方法将质粒pPIC9K-Gal1转化到毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在MD平板上，30℃培养4天，用无菌水吹取MD平板表面的克隆涂布于含有4mg/mLG418的YPD平板上，30℃培养5天，挑选阳性克隆作为出发菌株；所述的质粒pPIC9K-Gal1为经DNA限制性内切酶PmeⅠ酶切过的质粒；（3）、构建共表达质粒pPICZαA-PVT-Gal1：以与步骤（1）同样的方法构建毕赤酵母表达质粒pPICZαA-Gal1，用DNA限制性内切酶BamHⅠ酶切基因片段PVT以及毕赤酵母表达质粒pPICZαA-Gal1，之后用T4DNA连接酶将PVT连接进表达质粒pPICZαA-Gal1中，形成共表达质粒pPICZαA-PVT-Gal1；所述基因片段PVT为将透明颤菌血红蛋白基因vgb置于树干毕赤酵母低氧诱导启动子PsADH2及终止子之间形成的DNA片段；（4）、构建共表达毕赤酵母工程菌株：按照Invitrogen公司的酵母转化方法，将第（2）步得到的出发菌株制作成感受态细胞，将共表达质粒pPICZαA-PVT-Gal1电转化至其中，涂布在含100μg/mL博来霉素的YPDS平板上筛选阳性克隆，得到共表达毕赤酵母工程菌株；所述共表达质粒pPICZαA-PVT-Gal1为经DNA限制性内切酶PmeⅠ酶切后的质粒；所述的毕赤酵母工程菌株在棉子糖水解中的应用。本专利技术制备方法简单，新颖独特，易操作，表达效果好，可有效解决通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量，并实现毕赤酵母工程菌在α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量中的应用，经济和社会效益显著。附图说明图1为本专利技术摇瓶表达高活性菌株筛选发酵液酶活均有显著提升图。具体实施方式以下结合实施例和具体情况对本专利技术的具体实施方式作详细说明。本专利技术在具体实施中，一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法，包括以下步骤：（1）、构建表达质粒pPIC9K-Gal1：表达基因为米根毛霉（Rhizomucormiehei）来源的一个α-半乳糖苷酶基因Gal1，按照毕赤酵母密码子偏好性对mRNA二级结构、GC含量优化，确定序列为SEQ1，基因合成后，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对α-半乳糖苷酶基因和毕赤酵母甲醇诱导型表达载体pPIC9K同时进行双酶切，之后，用T4DNA连接酶将α-半乳糖苷酶基因连接进载体pPIC9K中，形成表达质粒pPIC9K-Gal1，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对质粒进行酶切检测，以确保质粒构建成功；（2）、构建甲醇诱导型表达α-半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌出发菌株：按照Invitrogen公司的酵母转化方法，用DNA限制性内切酶PmeⅠ对质粒pPIC9K-Gal1线性化后电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在MD平板上，30℃培养4天，用无菌水吹取MD平板表面的克隆涂布于含有4mg/mLG418的YPD平板上，30℃培养5天；挑取单克隆接种至50mL（250mL锥形瓶）YPD培养基中培养，30℃培养3天，离心，收集菌体，转入装有50mLBMMY培养基的锥形瓶中诱导表达，每天补加BMMY培养基体积1%的甲醇，3天后测定发酵液中α-半乳糖苷酶酶活，取100µL发酵液和浓度10mmol/L的的pNPG溶液100µL混合，60℃下反应10min，加入800µL0.5mo/L的Na2CO3溶液终止反应，取200µL加入到96孔板中，用酶标仪测405nm处吸收值，代入对硝基苯（pNP）测定的标准曲线，得α-半乳糖苷酶的活力值，选取保存活性最高的克隆最为毕赤酵母工程菌出发菌株；所述的α-半乳糖苷酶酶活定义为：每分钟水解对硝基苯-α-D-半乳糖苷（pNPG）产生1µmol的对硝基苯酚（pNP）所需的酶量定义为1个α-半乳糖苷酶酶活单位；所述的BMMY培养基的配制方法是：酵母粉10g、蛋白胨20g、KH2PO411.8g、K2HPO43g，加水至890mL，121℃灭菌20分钟，温度降至60℃以下时加入浓度13.4g/L过滤灭菌的YNB（无氨基酵母氮源）溶液100mL、0.4mg/L的生物素溶液1mL、甲醇5mL，混匀制成；所述的YPD培养基配制方法是，酵母粉10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，加水至1000mL，108℃灭菌20分钟；（3）、构建共表达质粒pPICZαA-PVT-Gal1以与步骤（1）同样的方法构建毕赤酵母表达质粒pP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中

【技术特征摘要】
1.一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、构建表达质粒pPIC9K-Gal1：用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对α-半乳糖苷酶基因Gal1和毕赤酵母甲醇诱导型表达载体pPIC9K同时进行双酶切，之后用T4DNA连接酶将α-半乳糖苷酶基因连接进载体pPIC9K中，形成表达质粒pPIC9K-Gal1；
所述α-半乳糖苷酶基因为在密码子、mRNA二级结构和GC含量方面进行优化后的米根毛霉（Rhizomucormiehei）来源的一个α-半乳糖苷酶基因；
（2）、构建甲醇诱导型表达α-半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌出发菌株：按照Invitrogen公司的酵母转化方法将质粒pPIC9K-Gal1转化到毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在MD平板上，30℃培养4天，用无菌水吹取MD平板表面的克隆涂布于含有4mg/mLG418的YPD平板上，30℃培养5天，挑选阳性克隆作为出发菌株；
所述的质粒pPIC9K-Gal1为经DNA限制性内切酶PmeⅠ酶切过的质粒；
（3）、构建共表达质粒pPICZαA-PVT-Gal1：以与步骤（1）同样的方法构建毕赤酵母表达质粒pPICZαA-Gal1，用DNA限制性内切酶BamHⅠ酶切基因片段PVT以及毕赤酵母表达质粒pPICZαA-Gal1，之后用T4DNA连接酶将PVT连接进表达质粒pPICZαA-Gal1中，形成共表达质粒pPICZαA-PVT-Gal1；
所述基因片段PVT为将透明颤菌血红蛋白基因vgb置于树干毕赤酵母低氧诱导启动子PsADH2及终止子之间形成的DNA片段；
（4）、构建共表达毕赤酵母工程菌株：按照Invitrogen公司的酵母转化方法，将第（2）步得到的出发菌株制作成感受态细胞，将共表达质粒pPICZαA-PVT-Gal1电转化至其中，涂布在含100μg/mL博来霉素的YPDS平板上筛选阳性克隆，得到共表达毕赤酵母工程菌株；
所述共表达质粒pPICZαA-PVT-Gal1为经DNA限制性内切酶PmeⅠ酶切后的质粒。


2.根据权利要求1所述的通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、构建表达质粒pPIC9K-Gal1：
表达基因为米根毛霉（Rhizomucormiehei）来源的一个α-半乳糖苷酶基因Gal1，按照毕赤酵母密码子偏好性对mRNA二级结构、GC含量优化，确定序列为SEQ1（见序列表SEQ1），基因合成后，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对α-半乳糖苷酶基因和毕赤酵母甲醇诱导型表达载体pPIC9K同时进行双酶切，之后，用T4DNA连接酶将α-半乳糖苷酶基因连接进载体pPIC9K中，形成表达质粒pPIC9K-Gal1，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对质粒进行酶切检测，以确保质粒构建成功；
（2）、构建甲醇诱导型表达α-半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌出发菌株：
按照Invitrogen公司的酵母转化方法，用DNA限制性内切酶PmeⅠ对质粒pPIC9K-Gal1线性化后电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在MD平板上，30℃培养4天，用无菌水吹取MD平板表面的克隆涂布于含...

【专利技术属性】
技术研发人员：刁文涛，李珊珊，陈国参，王雪妍，周伏忠，陈晓飞，马焕，杨文玲，杜志敏，权淑静，刘德海，王继雯，张英涛，解复红，
申请(专利权)人：河南省科学院生物研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：河南;41