一种适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。本发明专利技术首次利用CRISPR/Cas9技术构建胶霉毒素生物合成基因被敲除的重组埃德菌FS110菌株，建立了一种适用于深海真菌埃德菌FS110的CRISPR/Cas9基因敲除体系，从而促进埃德菌FS110的基因工程改造，为埃德菌FS110胶霉毒素的生物合成机制的阐明以及获得更多具有显著生物学活性的胶霉毒素类衍生物奠定分子生物学基础。

A CRISPR / cas9 vector suitable for edbacteria FS110 and its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用
本专利技术属于生物化学和分子生物学
，具体涉及一种适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。
技术介绍
深海真菌埃德菌(Dichotomomycescejpii)FS110是一种来源于深海的子囊菌，其能产生大量新型具有抗肿瘤活性的胶霉毒素。前期已经从深海真菌埃德菌FS110中分离得到了30种左右胶霉毒素类化合物，还包括结构罕见的胶霉毒素类二聚体化合物，其中大部分胶霉毒素类化合物物具有较好的抗肿瘤活性及抗α-葡萄糖苷酶的活性，因此具有开发成为药物先导化合物的前景。在此基础上，对埃德菌FS110进行了基因组测序，预测了胶霉毒素生物合成基因簇，并对关键胶霉毒素生物合成功能基因进行了体外生化功能验证。但是目前由于深海真菌埃德菌基因敲除体系尚未成功建立，因此胶霉毒素的生物合成机制尚未阐明，不利于通过代谢工程改造获得新型具有更好生物学活性的胶霉毒素类化合物及其衍生物。CRISPR/Cas9是一种由sgRNA介导Cas9核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。RuVC1和HNH两个核酸酶活性区域使其具有内切酶活性，在gRNA引导下能对靶标基因进行切割。CRISPR/Cas9系统由于基因敲除效率高、构建简单，成本较低等优点已经在哺乳动物细胞、干细胞和植物等真核细胞的基因组编辑方面有着十分广泛的应用，而由于相应载体的缺乏，CRISPR/Cas9系统在丝状真菌中较少，尚未见到利用CRISPR/Cas9系统提对深海真菌进行基因敲除的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种适用于深海真菌埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。本专利技术的第一个目的是提供适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体的构建方法，包括以下步骤：a.以埃德菌FS110基因组DNA为模板，以引物5SrRNA-promoter-F、5SrRNA-promoter-R作为引物进行PCR扩增，得到含有一个BglII酶切位点的5SrRNA启动子的片段1，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；b.以人工合成sgRNA序列及其终止子序列为模板，以引物5SrRNA-sgRNA-F、sgRNA-Terminator-R作为引物进行PCR扩增，得到含有一个PacI酶切位点、sgRNA及其终止子的片段2，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；c.将步骤a得到的片段1和步骤b得到的片段2混合作为模板，进行融合PCR，得到5SrRNA启动子-靶向序列-sgRNA-sgRNA终止子片段；d.对pFC332质粒、步骤c得到的5SrRNA启动子-靶向序列-sgRNA-sgRNA终止子片段分别进行PacI和BglII双酶切，酶切后的片段用T4DNA连接酶进行连接，得到适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体pFC332-sgRNA。本专利技术还提供根据所述的构建方法构建得到的适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体pFC332-sgRNA。本专利技术还提供含有所述的适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体pFC332-sgRNA的真菌。本专利技术还提供所述的适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体pFC332-sgRNA在真菌基因敲除中的应用。优选，所述的真菌为埃德菌FS110或埃德菌FS140。优选，所述的真菌为埃德菌FS110。优选，所述的应用，包括以下步骤：a.在待敲除的基因中寻找靶向位点，对应设计靶向引物并退火形成双链，将其酶切连接至载体pFC332-sgRNA中，得到的靶向敲除重组载体；b.将靶向敲除重组载体通过原生质体介导法导入埃德菌FS110原生质体，用潮霉素抗性PDA平板筛选，挑取阳性克隆基因组DNA验证重组载体的导入，并通过CruiserEnzyme切割和测序验证目标基因的敲除。优选，所述的应用，为靶向敲除胶霉毒素生物合成基因GliG，包括以下步骤：针对基因GliG设计靶向引物为gliG-F1和gliG-R1，利用T4PNK酶进行磷酸化并退火反应形成gliG-F1/gliG-R1双链；所述的gliG-F1，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述的gliG-R1，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；以构建的载体pFC332-sgRNA为模板，以引物BglII-F、PacI-R作为引物进行PCR扩增，然后对该PCR产物和gliG-F1/gliG-R1双链进行BglII和PacI双酶切，酶切产物胶回收，利用T4Ligase连接转化，构建得到G1-pFC332-sgRNA质粒即为靶向敲除胶霉毒素生物合成基因GliG的重组载体。优选，所述的应用，为靶向敲除胶霉毒素生物合成基因GliO，包括以下步骤：针对基因GliO设计靶向引物为gliO-F1和gliO-R1，利用T4PNK酶进行磷酸化并退火反应形成gliO-F1/gliO-R1双链；所述的gliO-F1，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述的gliO-R1，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；以构建的载体pFC332-sgRNA为模板，以引物BglII-F、PacI-R作为引物进行PCR扩增，然后对该PCR产物和gliO-F1/gliO-R1双链进行BglII和PacI双酶切，酶切产物胶回收，利用T4Ligase连接转化，构建得到O1-pFC332-sgRNA质粒即为靶向敲除胶霉毒素生物合成基因GliO的重组载体。本专利技术构建了适用于深海真菌埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体，并对胶霉毒素生物合成基因进行敲除，为后期解析FS110胶霉毒素生物机制奠定分子生物学基础，促进胶霉毒素类化合物的开发利用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：目前，真菌的基因敲除一般采取Cre/loxp同源重组的方法进行基因敲除，但存在同源重组效率低，载体构建复杂等缺点，导致丝状真菌基因敲除进展缓慢，严重阻碍了丝状真菌的遗传操作改造和新型次级代谢产物的发掘。CRISPR/Cas9基因敲除系统具有载体构建简单，基因敲除效率相对较高等优势，能有效促进丝状真菌的遗传工程改造，从而发掘更多具有生物活性的先导化合物。本专利技术的埃德菌(Dichotomomycescejpii)FS110，其公开于文献：杨小岚，陈玉婵，李浩华，章卫民，23株海洋真菌的分子鉴定及其抗植物病原菌和细胞毒活性研究，生物技术通报，2014,8:132-137。该菌种本申请人也持有，保证自本专利技术的申请日起20年内向公众提供。附图说明图1为pFC332-sgRNA质粒图谱及验证；其中，图A为pFC332-sgRNA质粒图谱，图B为重组载体构建验证图。图2为重组载体G1-pFC332-sgRNA或O1-pFC332-sgRNA导入埃德菌FS110的验证图；其中A为潮霉素抗性PDA平板上的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/na.以埃德菌FS110基因组DNA为模板，以引物5SrRNA-promoter-F、5SrRNA-promoter-R作为引物进行PCR扩增，得到含有一个BglII酶切位点的5SrRNA启动子的片段1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；/nb.以人工合成sgRNA序列及其终止子序列为模板，以引物5SrRNA-sgRNA-F、sgRNA-Terminator-R作为引物进行PCR扩增，得到含有一个PacI酶切位点、sgRNA及其终止子的片段2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；/nc.将步骤a得到的片段1和步骤b得到的片段2混合作为模板，进行融合PCR，得到5SrRNA启动子-靶向序列-sgRNA-sgRNA终止子片段；/nd.对pFC332质粒、步骤c得到的5SrRNA启动子-靶向序列-sgRNA-sgRNA终止子片段分别进行PacI和BglII双酶切，酶切后的片段用T4 DNA连接酶进行连接，得到适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体pFC332-sgRNA。/n...

【技术特征摘要】
1.一种适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.以埃德菌FS110基因组DNA为模板，以引物5SrRNA-promoter-F、5SrRNA-promoter-R作为引物进行PCR扩增，得到含有一个BglII酶切位点的5SrRNA启动子的片段1，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
b.以人工合成sgRNA序列及其终止子序列为模板，以引物5SrRNA-sgRNA-F、sgRNA-Terminator-R作为引物进行PCR扩增，得到含有一个PacI酶切位点、sgRNA及其终止子的片段2，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；
c.将步骤a得到的片段1和步骤b得到的片段2混合作为模板，进行融合PCR，得到5SrRNA启动子-靶向序列-sgRNA-sgRNA终止子片段；
d.对pFC332质粒、步骤c得到的5SrRNA启动子-靶向序列-sgRNA-sgRNA终止子片段分别进行PacI和BglII双酶切，酶切后的片段用T4DNA连接酶进行连接，得到适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体pFC332-sgRNA。


2.一种根据权利要求1所述的构建方法构建得到的适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体pFC332-sgRNA。


3.一种含有权利要求2所述的适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体pFC332-sgRNA的真菌。


4.权利要求2所述的适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体pFC332-sgRNA在真菌基因敲除中的应用。


5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的真菌为埃德菌FS110或埃德菌FS140。


6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
a.在待敲除的基因中寻找靶向位点，对应设计靶向引物并退火形成双链，将其酶切连接至...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶伟，黄自磊，章卫民，李赛妮，朱牧孜，孔亚丽，刘桃妹，刘珊，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：广东;44