一种深海真菌新型乙酰转移酶GliK及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种深海真菌新型乙酰转移酶GliK及其编码基因和应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示将乙酰转移酶GliK的编码基因克隆入大肠杆菌表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的乙酰转移酶GliK，通过诱导表达得到深海真菌FS140新型乙酰转移酶GliK纯化蛋白，对其进行酶学性质测定结果表明新型乙酰转移酶GliK最适反应温度为35℃，最适PH值为7，热稳定性较好，该酶反应动力学参数Km和Vmax的值分别为302.8μM和4092U/mg。通过对GliK的酶学性质分析测定发现来源于深海真菌G.pallida FS140的GliK基因极有可能是一种新型的乙酰转移酶，在胶霉毒素酰基化过程中发挥关键作用。这为后期通过转录调控和异源表达以提升乙酰胶霉毒素的表达水平并获得新型胶霉毒素奠定分子生物学基础。

【技术实现步骤摘要】
一种深海真菌新型乙酰转移酶GliK及其编码基因和应用
本专利技术属于生物化学和分子生物学
，具体涉及一种深海真菌新型乙酰转移酶GliK及其编码基因和应用。
技术介绍
胶霉毒素(gliotoxin，GT)是一种重要的疏水性真菌代谢产物，属于表聚硫代哌嗪二酮类化合物(Epidithiodiketopiperazines，ETPs)。ETPs是一类主要由真菌产生的活性次级代谢产物，其结构特征是都含有二硫键的二酮哌嗪(diketopiperazine，DKP)核心，具有广泛的生物活性，包括抗增殖、细胞毒、免疫抑制、抗病毒以及抗菌等生物活性。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种深海真菌来源的新型乙酰转移酶GliK。本专利技术的乙酰转移酶GliK，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第二个目的是提供编码上述乙酰转移酶GliK的乙酰转移酶基因GliK。优选，所述的乙酰转移酶基因GliK的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的第三个目的是提供含有上述的乙酰转移酶基因GliK的重组表达质粒，以及含有该重组表达质粒的重组基因工程菌株。本专利技术的第四个目的是提供上述乙酰转移酶GliK在催化胶霉毒素得到乙酰胶霉毒素中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术所涉及的深海真菌G.pallidaFS140分离自南海沉积物，本课题组前期对该菌进行了转录组测序并对胶霉毒素生物合成相关基因进行了注释。鉴于目前关于深海真菌G.pallidaFS140的胶霉毒素生物合成基因GliK的功能相关研究尚未见报道，而转录组测序及文献调研结果也表明，编码胶霉毒素的生物合成基因GliK是个假定蛋白，在GT生物合成途径中的具体功能还不清楚。因此本专利技术通过载体构建大量表达，纯化获得深海真菌FS140新型乙酰转移酶基因GliK蛋白，并进行酶学性质测定，从而为后期通过转录调控和异源表达以提升乙酰胶霉毒素的表达水平并获得新型胶霉毒素奠定分子生物学基础。本专利技术的深海真菌G.pallidaFS140，其公开于文献：Zhang-HuaSun,JiangyongGu,WeiYe,Liang-XiWen,Qi-BinLin,Sai-NiLi,Yu-ChanChen,Hao-HuaLi,Wei-MinZhang.GeospallinsA–C:NewThiodiketopiperazineswithInhibitoryActivityagainstAngiotensin-ConvertingEnzymefromaDeep-Sea-DerivedFungusGeosmithiapallidaFS140.MarineDrugs2018,16(12),464.https://doi.org/10.3390/md16120464。该菌种本申请人也持有，保证自专利技术的申请日起20年内向公众提供。附图说明图1为深海真菌FS140新型乙酰转移酶基因GliK序列的获得：其中A为重组载体pET30a-GliK构建载体图谱；B为以FS140cDNA文库为模板，基因GliK扩增产物的电泳图；图2为纯化得到新型乙酰转移酶GliK蛋白验证；其中A为SDS-PAGE蛋白电泳图；B为Western-blot验证图，并经质谱验证；图3为新型乙酰转移酶GliK的酶学性质测定结果图表。具体实施方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。本实施例中所用的YPD固体培养基的配方为：每升含有酵母粉10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g和琼脂粉20g，余量为蒸馏水，其配制方法是将各成分混合均匀，灭菌制得。实施例1深海真菌G.pallidaFS140新型乙酰转移酶基因GliK表达载体构建与蛋白纯化将深海真菌G.pallidaFS140接种于YPD培养基平板，37℃培养72h，挑取新鲜的菌丝体，利用植物RNA提取试剂盒提取RNA，利用All-in-oneRTMasterKit逆转录获得cDNA，保存于-20℃备用。通过转录组测序获得编码新型乙酰转移酶的胶霉毒素生物合成基因GliK(GliK基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，具体为：atgaccatacaactccctcacacacctgacagagaagaaggccctggtgcttctcctgcatgcaagttcaatgcaatccagacattccggtggttatgggacctagtcatcccaactagcgaccttactcaagaaaccggtcgatatcctccgaagacgacgatcgagagacggcgcgcatcaaccacagatagatcgctcgataaggacgaatacctagctgagaaggtcgcaggtcatcaggtcgaagaacatgtccccccggagaagaccgtcctctacctcgcgtacggctcgaatctggccgcggagaccttcctgggcaagcgaggcattaggcctctatcccagatcaacgttgtcgttcccggcctacgactaactttcgaccttcctgggttaccatacgttgagccatgcttcgcagcgactcggcactggactcatacaccaagagtaacacaaacagaaggaaatggaagtaatgaaggggtcgatgcagaagtgttggagaattcgtccctcgtgccacaggagaagaacgacatgcctctcgtcggcgtcgtgtatgaggtcactgtcgccgattatgccaagataatagccacagagggtggtgggcgcggataccgagacgtcgttgtcgattgctatccttttcccaaatcatacagtcccaccgatccggtccctgagtgccccgaaaccaaacccttcaagtcccacaccctcctctctccagccgacgacgcagtctcgggtctcctggccgcagggaagtcataccgacccgtccgacccaatcctggctacgcccagccctccgcttga)，使用引物pET30a-GliK-F:(划线为NdeI识别序列)；pET30a-GliK-R:(划线为XhoI识别序列)。以菌株FS140cDNA为模板，进行GliK的基因扩增，反应程序：98℃变性5min，以98℃20s，55℃15s，72℃20s反应35个循环后，72℃延伸7min，最后冷却至4℃。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳验证后(图1B)采用PCR产物纯化试剂盒纯化。然后采用限制性内切酶NdeI和XhoI对pET-30a载体进行双酶切。酶切产物经胶回收试剂盒回收，利用ClonExpressIIOneStepCloningKitC112(Vazyme)同源重组试剂盒将克隆出的GliK片段重组至pET-30a载体中，转化至trans5α感受态中，利用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆测序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.乙酰转移酶GliK，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.乙酰转移酶GliK，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.一种编码权利要求1所述的乙酰转移酶GliK的乙酰转移酶基因GliK。


3.根据权利要求2所述的乙酰转移酶基因GliK，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李赛妮，章卫民，许丽琼，陈玉婵，叶伟，李浩华，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：广东;44