一种双歧杆菌的选择性分离培养基制造技术

本发明专利技术提供了一种双歧杆菌的选择性分离培养基，由以下质量浓度的组分组成：月示胨10.0g/L、大豆胨3g/L、酵母浸粉5g/L、牛肉浸粉2.2g/L、消化血清粉13.5g/L、牛肝浸粉1.2g/L、木聚糖1

【技术实现步骤摘要】
一种双歧杆菌的选择性分离培养基


[0001]本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种利用木聚糖作为主要碳源的选择性分离培养双歧杆菌的培养基。

技术介绍

[0002]双歧杆菌(Bifidobacterium)是属于放线菌门的革兰氏阳性，严格厌氧，糖分解细菌。双歧杆菌代表了一个重要的共生群体，是肠道的第一批微生物定殖者。而越来越多的研究表明双歧杆菌与人体健康存在密切的联系，同时双歧杆菌也是目前公认的益生菌，具有很高的商业价值。早在1899年Tissier就首次从母乳喂养的婴儿粪便中分离出双歧杆菌，此后，双歧杆菌从一系列不同的生态环境中分离出来，如口腔、昆虫肠道以及各种哺乳动物的胃肠道。
[0003]GAM培养基，是由不同营养物质组合配制而成的营养基质，含有碳水化合物、含氮物质、无机盐、维生素和水等几大类物质，适用于厌氧菌的培养。在传统的GAM培养基中，双歧杆菌生长的同时也有许多杂菌的生长，杂菌长势甚至优于双歧杆菌。因此，不利于从样本中筛选分离双歧杆菌，寻求一种双歧杆菌的选择性分离培养基，在能提供双歧杆菌必须营养物质的同时，还能抑制其他微生物的生长。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种双歧杆菌的选择性分离培养基，本专利技术培养是在GAM培养基的基础上，以木聚糖作为主要碳源，将现有GAM培养基中单糖改为难以降解的多糖。本专利技术旨在利用木聚糖作为主要碳源以促进双歧杆菌的生长同时也减少样本中其他杂菌的生长，本专利技术的选择分离培养基可在同一样本和同样的培养条件下更有利于双歧杆菌的生长，提高双歧杆菌的在菌落中的相对丰度。
[0005]为了实现本专利技术的目的采用以下技术方案：
[0006]一种双歧杆菌的选择性分离培养基，由以下质量浓度的组分组成：月示胨10.0g/L、大豆胨3g/L、酵母浸粉5g/L、牛肉浸粉2.2g/L、消化血清粉13.5g/L、牛肝浸粉1.2g/L、木聚糖1
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10g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、氯化钠3g/L、L
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半胱氨酸0.3g/L、硫乙醇酸钠0.3g/L。
[0007]由于双歧杆菌所在的肠道中单糖是有限的，因此双歧杆菌需要拥有各种糖苷酶和糖转运蛋白来降解难消化的多糖、寡糖和复杂的碳水化合物。因此，双歧杆菌的基因组中有超过12％的注释开放阅读框被预测为编码参与碳水化合物代谢的酶；同时，双歧杆菌核心基因组中还有5.5％的序列与碳水化合物代谢有关。因此，基于双歧杆菌碳水化合物活性酶的特性，本专利技术设计了以难以降解的多糖作为主要碳源的选择性培养基，可在提供双歧杆菌必须营养物质的同时，还能抑制其他微生物的生长。
[0008]优选地，所述双歧杆菌的选择性分离培养基还包括琼脂。在本专利技术的培养基中加入琼脂，可制备固体平板培养基。
[0009]优选地，所述双歧杆菌的选择性分离培养基，由以下质量浓度的组分组成：月示胨
10.0g/L、大豆胨3g/L、酵母浸粉5g/L、牛肉浸粉2.2g/L、消化血清粉13.5g/L、牛肝浸粉1.2g/L、木聚糖2
‑
8g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、氯化钠3g/L、L
‑
半胱氨酸0.3g/L、硫乙醇酸钠0.3g/L。
[0010]优选地，所述双歧杆菌的选择性分离培养基，由以下质量浓度的组分组成：月示胨10.0g/L、大豆胨3g/L、酵母浸粉5g/L、牛肉浸粉2.2g/L、消化血清粉13.5g/L、牛肝浸粉1.2g/L、木聚糖4g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、氯化钠3g/L、L
‑
半胱氨酸0.3g/L、硫乙醇酸钠0.3g/L。经大量试验验证，最终当木聚糖为4g/L时，双歧杆菌的相对丰度最高。
[0011]本专利技术还提供了一种分离双歧杆菌的方法，包括以下步骤：
[0012]步骤一：取新鲜的粪便样本，用生理盐水依次梯度稀释成不同浓度的稀释液；将所述稀释液均匀涂布在用权利要求1培养基制备的平板上，随后放入厌氧工作站中培养48
‑
72h；
[0013]步骤二：从步骤一平板上挑取疑似双歧杆菌的单菌落，在用权利要求1培养基制备的平板上进行划线纯化，然后放入厌氧工作站培养48
‑
72h；
[0014]步骤三：从步骤二划线纯化的平板上挑取疑似双歧杆菌的单菌落，再次在用权利要求1培养基制备的平板上划线进行纯化，然后放入厌氧工作站中培养48
‑
72h；
[0015]步骤四：利用质谱仪从平板上挑选的单菌落进行物种鉴定。
[0016]优选地，所述梯度稀释的浓度分别为10
‑4、10
‑5和10
‑6。
[0017]本专利技术的有益效果为：本专利技术的选择性分离培养基以木聚糖作为主要碳源，将现有GAM培养基中单糖改为难以降解的多糖。本专利技术优化的GAM培养基对双歧杆菌的选择性分离效果更好，即平板上的双歧杆菌不仅数量增多同时平板上的其他微生物种类也减少。而可培养双歧杆菌总菌数占平板上可培养微生物的总菌数的百分比可达53.95
±
1.22(传统GAM为17.90
±
0.58)。
附图说明
[0018]图1不同碳源下门水平上微生物的相对丰度示意图
[0019]图2不同碳源下属水平上微生物的相对丰度示意图
[0020]图3不同碳源下种水平上微生物的相对丰度示意图
具体实施方式
[0021]为了更加简洁明了的展示本专利技术的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例详细说明本专利技术的技术方案。
[0022]实施例1
[0023]本专利技术获得以木聚糖作为碳源的具体过程如下：
[0024]从NCBI中下载得到的144条双歧杆菌全基因组，将核心基因与总基因数以及注释信息采用原核生物泛基因组自动化分析软件(Pan
‑
Genomics Analysis Pipeline，PGAP)中的MP方法来分析，再通过本地Perl脚本对分析结果进行处理。同时这144条全基因组也利用在线软件dbCAN
‑
seq database进行糖苷水解酶单独注释以挖掘双歧杆菌共有的糖苷水解酶家族。而样本的宏基因组测序结果则是通过Trimmomatic v0.39(Bolger et al.，2014)除去带有Perl脚本和低质量数据的条形码，并通过CLC(Qiagen,Germany)除去宿主DNA。然
后使用SPAdes 3.12.0(Nurk，2013)进行组装，并使用Prokka 1.13.7(Seemann，2014)进行注释。最后基于泛基因组分析和宏基因组分析结果选择以木聚糖作为碳源。
[0025]本实施例提供一种双歧杆菌的选择性分离培养基，由以下质量浓度的组分组成：月示胨10.0g/L、大豆胨3g/L、酵母浸粉5g/L、牛肉浸粉2.2g/L、消化血清粉13.5g/L、牛肝浸粉1.2g/L、木聚糖1g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、氯化钠3g/L本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双歧杆菌的选择性分离培养基，其特征在于，所述培养基由以下质量浓度的组分组成：月示胨10.0g/L、大豆胨3g/L、酵母浸粉5g/L、牛肉浸粉2.2g/L、消化血清粉13.5g/L、牛肝浸粉1.2g/L、木聚糖1
‑
10g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、氯化钠3g/L、L
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半胱氨酸0.3g/L、硫乙醇酸钠0.3g/L。2.如权利要求1所述的双歧杆菌的选择性分离培养基，其特征在于，所述双歧杆菌的选择性分离培养基，由以下质量浓度的组分组成：月示胨10.0g/L、大豆胨3g/L、酵母浸粉5g/L、牛肉浸粉2.2g/L、消化血清粉13.5g/L、牛肝浸粉1.2g/L、木聚糖2
‑
8g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、氯化钠3g/L、L
‑
半胱氨酸0.3g/L、硫乙醇酸钠0.3g/L。3.如权利要求1所述的双歧杆菌的选择性分离培养基，其特征在于，由以下质量浓度的组分组成：月示胨10.0g/L、大豆胨3g/L、酵母浸粉5g/L、牛肉浸粉2.2g/L、消化血清粉13.5g/L、牛肝浸粉1.2g/L、木聚糖4g/L、磷酸二氢钾2...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢新强，杨双红，张菊梅，吴清平，杜明珠，蔡淑珍，柏建玲，李龙岩，李滢，杨玲双，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：