重组酵母菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种重组酵母菌株的构建方法，包括步骤：合成多个异源启动子；构建β‑胡萝卜素基因表达模块，包括β‑胡萝卜素生产相关基因、β‑胡萝卜素生产相关基因上游的所述启动子和所述β‑胡萝卜素生产相关基因下游的终止子；将β‑胡萝卜素基因表达模块转化至酿酒酵母中以获得所述重组酵母。本发明专利技术提供的构建方法获得的重组酵母菌株中具有多种高活性的异源启动子，使得酿酒酵母高产、稳定的特点。另外，本发明专利技术还提供了一种重组酵母菌株及其应用。

Recombinant yeast strain and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
重组酵母菌株及其构建方法和应用
本专利技术涉及重组酵母菌株领域及其构建方法和应用。
技术介绍
β-胡萝卜素具有重要的生理功能，是合成人体维生素A的前体物质，能增强人体免疫能力、预防多种疾病例如动脉硬化及癌症等，具有抗氧化及延缓衰老的活性，广泛的应用于药品、化妆品、食品及保健品等，因此具有非常大的市场价值。酿酒酵母是食品级安全的微生物，且基因组简单易于操作，发酵周期短等优势，是合成β-胡萝卜素的理想底盘细胞。现有技术中认为，β-胡萝卜素的生物合成涉及的关键酶包括四异戊二烯焦磷酸合成酶(CrtE/BTS1)、八青番茄红素脱氢酶(CrtI)、八青番茄红素合酶/番茄红素环化酶(CrtYB)等，而上述关键酶的表达有赖于酵母基因组中的各类启动子，活性偏低的启动子会导致β-胡萝卜素产量偏低，而且β-胡萝卜素的生物合成涉及多个基因的共同作用，使得某些启动子被反复用于基因的表达，可能导致重组菌株发酵的不稳定性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种重组酵母菌株，其基因组中具有高活性、异源启动子，使得酿酒酵母高产、稳定的特点。另外，本专利技术还提供了该重组酵母菌株在生产β-胡萝卜素中的应用。另外，本专利技术还提供了该重组酵母菌株的构建方法。本专利技术首先通过基因合成多个异源GAL启动子，包括SeGAL2，SkGAL2、SkGAL1、SpdGAL2、SptGAL2、SmGAL2以及SbGAL2。然后以绿色荧光蛋白作为报告蛋白，融合在不同所述多个异源GAL启动子的下游，构建重组质粒，并转化酿酒酵母。再通过流式细胞仪对重组菌株绿色荧光蛋白强度进行分析，筛选获得高活性的异源启动子SkGAL2、SeGAL2、SmGAL2和SptGAL2。最后以SeGAL2表达CrtE，SkGAL2表达CrtYB，SptGAL2表达CrtI，构建了能有效合成β-胡萝卜素的工程菌株。本专利技术提供的重组酵母菌株的构建方法获得的重组酵母菌株具有β-胡萝卜素产量高、多代遗传稳定的特点。附图说明图1为本专利技术实施例提供的多个异源启动子的活性。图2为本专利技术提供的重组酵母合成β-胡萝卜素的途径。图3为本专利技术提供的重组酵母中β-胡萝卜素基因表达模块示意图。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例中涉及的组分原料若无特殊说明，均为市面上能够购买的常用商品。本专利技术首先通过基因合成多个异源GAL启动子，所述多个异源GAL启动子包括：来源于真贝酵母(Saccharomyceseubayanus)的异源启动子SeGAL2；来源于库德里阿兹威酵母(Saccharomyceskudriavzevii)的异源启动子SkGAL2和异源启动子SkGAL1；来源于奇异酵母(Saccharomycesparadoxus)的异源启动子SpdGAL2；来源于巴氏酵母(Saccharomycespastorianus)的异源启动子SptGAL2；来源于麦卡特酵母(Saccharomycesmikatae)的异源启动子SmGAL2，以及来源于贝酵母(Saccharomycesbayanus)的异源启动子SbGAL2。然后以绿色荧光蛋白作为报告蛋白，融合在所述多个异源GAL启动子的下游，构建重组质粒，并转化酿酒酵母。再通过流式细胞仪对重组菌株绿色荧光蛋白强度进行分析，筛选以获得高活性的异源启动子SkGAL2、SeGAL2、SmGAL2和SptGAL2。相关异源启动子的活性请参见图1。最后以SeGAL2表达CrtE，SkGAL2表达CrtYB，SptGAL2表达CrtI，构建了能有效合成β-胡萝卜素的工程菌。相关反应途径请参见图2。以下具体实施例详细说明本专利技术重组酵母菌的构建方法。S1：异源启动子的合成以酿酒酵母的基因组为模板，通过引物ScGAL1-F及引物ScGAL1-R对酿酒酵母的内源ScGAL1基因进行PCR扩增，获得内源启动子ScGAL1作为对照，其中引物ScGAL1-F及引物ScGAL1-R的基因序列请参见表一。购买得到异源启动子SeGAL2、异源启动子SkGAL2、异源启动子SmGAL2、异源启动子SptGAL2、异源启动子SpdGAL2、异源启动子SkGAL1及异源启动子SbGAL2基因，其中，各异源启动子的基因序列如SEQ.NO.1所示。S2：将荧光蛋白基因分别融合在七个不同所述异源启动子的下游及一个所述内源启动子ScGAL1的下游，构建重组质粒，将重组质粒转化酿酒酵母，再分析重组酵母菌株的荧光蛋白强度，以筛选获得活性较高的异源启动子SeGAL2、异源启动子SkGAL2及异源启动子SptGAL2。在本专利技术实施例中，将荧光蛋白基因分别融合在八个不同所述异源启动子的下游之前还包括步骤：S21：以引物分别扩增八个所述异源启动子，具体包括：以引物ScGAL1-F和引物ScGAL1-R进行PCR扩增ScGAL1获得基因片段1；以引物SeGAL2-F和引物SeGAL2-R进行PCR扩增SeGAL2获得基因片段2；以引物SkGAL2-F和引物SkGAL1-R进行PCR扩增SkGAL1获得基因片段3；以引物SkGAL2-F和引物SkGAL2-R进行PCR扩增SkGAL2获得基因片段4；以引物SmGAL2-F和引物SmGAL2-R进行PCR扩增SmGAL2获得基因片段5；以引物SptGAL2-F和引物SptGAL2-R进行PCR扩增SptGAL2获得基因片段6；以引物SpdGAL2-F和引物SpdGAL2-R进行PCR扩增SpdGAL2获得基因片段7；以引物SbGAL2-F和引物SbGAL2-R进行PCR扩增SbGAL2获得基因片段8；其中，所述引物SeGAL2-F、SeGAL2-R、SkGAL2-F、SkGAL1-R、SkGAL2-R、SmGAL2-F、SmGAL2-R、SptGAL2-F、SptGAL2-R、SpdGAL2-F、SpdGAL2-R的序列如表一所示。表一：引物引物基因序列ScGAL1-F5‘-GTGACTCGGTCTCTACCTGGCTCCACAACCGCACCAGATCCG-3ScGAL1-R5’-GTTCTTCTCCCTTACCCATCTATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3’SeGAL2-F5’-GTGACTCGGTCTCTACCTGGCTCCACAGAGAACAGGAGATTAC-3’SeGAL2-R5’-GTTCTTCTCCCTTACCCATCTGTAAATGTGTGTATATATTATATTATAGC-3’...

【技术保护点】
1.一种重组酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括步骤：/n合成多个异源启动子；/n构建β-胡萝卜素基因表达模块，包括β-胡萝卜素生产相关基因、β-胡萝卜素生产相关基因上游的所述启动子和所述β-胡萝卜素生产相关基因下游的终止子；/n将β-胡萝卜素基因表达模块转化至酿酒酵母中以获得所述重组酵母菌株。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括步骤：
合成多个异源启动子；
构建β-胡萝卜素基因表达模块，包括β-胡萝卜素生产相关基因、β-胡萝卜素生产相关基因上游的所述启动子和所述β-胡萝卜素生产相关基因下游的终止子；
将β-胡萝卜素基因表达模块转化至酿酒酵母中以获得所述重组酵母菌株。


2.如权利要求1所述的重组酵母菌株的构建方法，其特征在于，在构建β-胡萝卜素基因表达模块之前还包括步骤：筛选所述多个异源启动子，所述筛选包括步骤：将荧光蛋白基因分别融合在所述异源启动子的下游，构建重组质粒，将重组质粒转化酿酒酵母，再分析重组酵母菌株的荧光蛋白强度，以筛选获得异源启动子SeGAL2、异源启动子SkGAL2及异源启动子SptGAL2。


3.如权利要求2所述的重组酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述多个异源启动子包括：异源启动子SeGAL2来源于真贝酵母、异源启动子SkGAL2来源于库德里阿兹威酵母及异源启动子SptGAL2来源于巴氏酵母。


4.如权利要求2所述的重组酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述β-胡萝卜素生产相关基因包括CrtE基因、CrtYB基因及CrtI基因，所述β-胡萝卜素生产相关基因上游的所述启动子包括异源启动子SeGAL2、异源启动子SkGAL2及异源启动子SptGAL2。


5.如权利要求2所述的重组酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述β-胡萝卜素生产相关基因上游的启动子，包括以异源启动子SeGAL2为模板，通过引物A、引物B进行PCR扩增包含同源重组同源臂的基因片段10；
以异源启动子SkGAL2为模板，通过引物C、引物D进行PCR扩增包含同源重组同源臂的基因片段11；以及以异源启动子SptGAL2为模板，通过引物E、引物F进行PCR扩增包含同源重组同源臂的基因片段12。


6.如权利要求1所述的重组酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述β-胡萝卜素生产相关基因，包括以CrtE基因为模板，通过引物G、引物H进行PCR扩增包含同源重组同源臂的基因片段13；
以CrtYB基因为模板，通过引物I、引物J进行PCR扩增包含同源重组同源臂的基因片段14；以及
以CrtI基因为模板，通过引物K、引物L进行PCR扩增包含同源重...

【专利技术属性】
技术研发人员：周希彬，
申请(专利权)人：森瑞斯生物科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44