产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌及构建方法技术

本发明专利技术公开产α‑蛇麻烯、8‑羟基‑α‑蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌及构建方法，其方法包括如下步骤：利用同源重组向酿酒酵母中导入优化的α‑蛇麻烯合酶编码基因ZSS1、优化的细胞色素P450酶编码基因CYP71BA1、优化的细胞色素P450还原酶编码基因AtCPR1和优化的脱氢酶编码基因ZSD1

Construction of recombinant Saccharomyces cerevisiae producing \u03b1 - snake, 8-hydroxy-\u03b1 - snake and gingerone

【技术实现步骤摘要】
产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌及构建方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种产α-蛇麻烯，8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的重组酿酒酵母菌及构建方法。
技术介绍
花姜酮是红球姜根茎中倍半萜的主要成分，近来研究发现，花姜酮具有抗炎、抗癌症功效，因而备受关注。花姜酮生物合成途径目前已经明确，类似于其他倍半萜化合物生物合成，其前体法尼基焦磷酸(FPP)来源于甲羟戊酸途径(MVA)。FPP经α-蛇麻烯合酶ZSS1催化合成α-蛇麻烯。α-蛇麻烯又称α-石竹烯或葎草烯，是一种天然的单环倍半萜类化合物。该物质于葎草科植物啤酒花的精油中发现，故又称葎草烯，啤酒中的α-蛇麻烯有抗感冒功效，α-蛇麻烯已发现具抗炎作用，并有可能成为一种有效的治疗炎症性疾病的药物。它产生类似地塞米松的疗效，且能减少由于注射组胺而造成的水肿，除此之外，α-蛇麻烯还具有抗癌功效。α-蛇麻烯经C8位点加羟基合成8-羟基-α-蛇麻烯，8-羟基-α-蛇麻烯经过脱氢获得花姜酮。萜类化合物在植物中积累较少，利用植物原料进行提取纯化往往收率低，纯度低且需要大量的植物原材料；利用化学合成的方法合成萜类已有广泛应用，然而对于结构复杂的萜类化合物，其依然困难且成本高昂。花姜酮目前仅发现存在于姜科植物中，虽然生物合成途径已阐释，然而其在植物宿主中的合成调控机理未有报道，通过代谢工程手段改造原有宿主提高花姜酮的产量依然困难。因此开发一种可高效合成天然产物的方法势在必行，然而截至目前利用合成生物学技术合成花姜酮未见报道。专利
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌。本专利技术的第二个目的是提供产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌的构建方法。本专利技术的第三个目的是提供产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌发酵产α-蛇麻烯，8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮中的应用。本专利技术的第四个目的是提供第二种产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌。本专利技术的第五个目的是提供第二种产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌的构建方法。本专利技术的第六个目的是提供第二种产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌发酵产α-蛇麻烯，8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮中的应用。本专利技术的第七个目的是提供第三种产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌。本专利技术的第八个目的是提供第三种产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌的构建方法。本专利技术的第九个目的是提供第三种产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌发酵产α-蛇麻烯，8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮中的应用。本专利技术的技术方案概述如下：产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌的构建方法，包括如下步骤：利用同源重组向酿酒酵母(ATCC:208352)中导入优化的α-蛇麻烯合酶编码基因ZSS1、优化的细胞色素P450酶编码基因CYP71BA1、优化的细胞色素P450还原酶编码基因AtCPR1和优化的脱氢酶编码基因ZSD1S114A；得到简称重组菌1的产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌1；所述优化的α-蛇麻烯合酶酶编码基因ZSS1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述优化的细胞色素P450酶编码基因CYP71BA1的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述优化的细胞色素P450还原酶编码基因AtCPR1的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述优化的脱氢酶编码基因ZSD1S114A的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。上述方法构建的产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌1。产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌1发酵产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮中的应用。第二种产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌的构建方法，包括如下步骤：向重组菌1中导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1及法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20，得到简称重组菌2的产α-蛇麻烯，8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的重组酿酒酵母菌2；所述3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；所述法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。上述方法构建的产α-蛇麻烯，8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌2。产α-蛇麻烯，8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌2发酵产α-蛇麻烯，8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮中的应用。第三种产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌的构建方法，包括如下步骤：利用同源重组用启动子PHXT1替换重组菌2中的鲨烯合酶编码基因ERG9的启动子PERG9得到重组菌3；所述启动子PHXT1的核苷酸序列用SEQIDNO.7所示。上述方法构建的产α-蛇麻烯，8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌3。产α-蛇麻烯，8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌3发酵产α-蛇麻烯，8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮中的应用。本专利技术的优点：实验证明，以酿酒酵母ATCC:208352为例，向酿酒酵母ATCC:208352中导入α-蛇麻烯合酶ZSS1编码基因ZSS1、细胞色素P450酶编码基因CYP71BA1、细胞色素P450还原酶编码基因AtCPR1和脱氢酶编码基因ZSD1S114A，得到的重组菌1，可以产生α-蛇麻烯，8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮；再提高重组菌1的tHMG1、ERG20的活性，可以提高α-蛇麻烯，8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的产量；用启动子PHXT1替换鲨烯合酶编码基因ERG9的原始启动子进一步提高α-蛇麻烯，8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的产量。本专利技术成功构建了生产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌株。为人工细胞合成α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮奠定了基础。附图说明图1为α-蛇麻烯GC-MS分析结果；(其中A，重组菌1，W303-1a及α-蛇麻烯标准品气质联用检测谱图；B，α-蛇麻烯标准品质谱图；C，样品峰2质谱图)图2为8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮GC-MS分析结果；(其中A，重组菌1，W303-1a及花姜酮标准品气质联用检测谱图；B，重组菌1色谱峰3质谱图；C，8-羟基-α-蛇麻烯气质联用检测谱图；D，重组菌1色谱峰1质谱图；E，花姜酮标准品质谱图)图3为各酿酒酵母重组菌株α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮产量的对比。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：利用同源重组向酿酒酵母中导入优化的α-蛇麻烯合酶编码基因ZSS1、优化的细胞色素P450酶编码基因CYP71BA1、优化的细胞色素P450还原酶编码基因AtCPR1和优化的脱氢酶编码基因ZSD1

【技术特征摘要】
1.产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：利用同源重组向酿酒酵母中导入优化的α-蛇麻烯合酶编码基因ZSS1、优化的细胞色素P450酶编码基因CYP71BA1、优化的细胞色素P450还原酶编码基因AtCPR1和优化的脱氢酶编码基因ZSD1S114A；得到简称重组菌1的产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌1；
所述优化的α-蛇麻烯合酶酶编码基因ZSS1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
所述优化的细胞色素P450酶编码基因CYP71BA1的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；
所述优化的细胞色素P450还原酶编码基因AtCPR1的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
所述优化的脱氢酶编码基因ZSD1S114A的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。


2.权利要求1的方法构建的产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌1。


3.权利要求2的产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌1发酵产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮中的应用。


4.产α-蛇麻烯、8-羟基-α-蛇麻烯及花姜酮的酿酒酵母重组菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：
向重组菌1中导入3-...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢文玉，张传波，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12