一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法，本方法以虾RNA为材料，通过反转录获得cDNA作为模板，设计Penaeidin3a.1基因特异性引物，经过PCR、酶切，将产物与烟草花叶病毒35S启动子和NOS终止子之间相连接，最终经过双酶切，构建到植物双元表达载体1301上。通过PCR鉴定、双酶切鉴定和基因测序，最终确定完成浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建。本项发明专利技术中构建方法具有简单、便捷、易操作、保存1301载体原有GUS基因易于进行筛选等特点，可应用于浮萍表达抗菌肽应用研究，是浮萍作为生产抗菌肽蛋白不可或缺的关键操作。

【技术实现步骤摘要】
一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法本专利技术得到国家重点研发计划资助(2018YFD0901301)，国家自然科学基金青年项目(31700443)，天津市水产产业技术体系创新团队(ITTFRS2017007)的资助。
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法。
技术介绍
在水产养殖业中，抗生素的大量使用造成了食物和水源的双重危害，且出现了相应的抗药性治病菌，目前已成为水产养殖业的一大问题。抗菌肽具有广谱抗菌性，并对部分病毒、寄生虫和癌细胞等均具有抗性，同时可提高免疫力和伤口愈合，是取代常规抗生素、解决致病菌抗药性问题的极佳选择。因此，将抗菌肽替代抗生素应用于生产实践越来越受到科学工作者和水产养殖业的重视。获得植物表达抗菌肽载体，可应用于利用浮萍生产抗菌肽的生产实际中，是利用浮萍作为植物反应器生产抗菌肽分析不可或缺的关键操作。
技术实现思路
本专利技术涉及一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法。本专利技术的目的构建浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS的载体，提供一种载体构建方法，特异性引物设计方案及其相关限制性内切酶的选择。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法的具体步骤如下所述：1)凡纳滨对虾cDNA的获得：取凡纳滨对虾组织进行研磨，提取RNA，反转录为cDNA。2)T-VPS的构建：利用VPS特异性引物，以凡纳滨对虾cDNA为模板，通过PCR技术获得带有特定酶切位点的抗菌肽基因，并将其连接到T-载体上，所述T-载体采用pMD19-T质粒，所述VPS特异性引物如下所述：VPS上游引物：GAAGATCTTCATGCGCCTCGTGGTCTGC，其中在5’末端加上了BglⅡ酶的酶切位点及保护碱基：GAAGATCTTC；VPS下游引物：AACTGCAGTCAACCGGAATATCCTTTC，其中在5’末端加上了PstI酶的酶切位点及保护碱基：AACTGCAG。3)启动子-VPS-终止子中间载体的构建：对启动子-cTP-终止子中间载体和T-Pen3同时进行双酶切，所采用的限制性内切酶为BglⅡ和PstI，产物利用T4连接酶进行连接。4)最终载体的构建：对启动子-VPS-终止子中间载体和pCAMBIA1301载体同时进行双酶切，所采用的限制性内切酶为SacI和EcoRI，对产物利用T4连接酶进行连接，经过PCR鉴定、双酶切鉴定和基因测序并比对结果为100％正确后，最终获得植物表达凡纳滨对虾VPS的载体。本专利技术的优点和有益效果为：本专利技术首创了浮萍表达抗菌肽载体的构建，利用该技术可在短时间获得产抗菌肽浮萍，国际上相继成立了多个浮萍生物反应器公司，但利用浮萍生产对虾抗菌肽的研究鲜有报道，其关键技术尚待突破。本专利技术通过对浮萍生产抗菌肽的关键技术进行探索，拟建立有效的对虾抗菌肽表达体系，具有重要的应用价值，对抗菌肽在产业中的应用具有推进作用，是浮萍合成生物学分析不可或缺的关键操作。附图说明图1为本专利技术载体构建技术路线图。图2为实施例的步骤3中VPS基因的PCR凝胶电泳图。图3为实施例的步骤3中pMD19-T-VPS载体验证结果凝胶电泳图，其中a为菌落PCR结果，b为酶切验证结果。图4为实施例的步骤3中pMD19-T-VPS的序列比对结果图。图5为实施例的步骤4中PSK-sgat质粒的凝胶电泳图。图6为实施例的步骤4中PSK-sgat质粒的酶切验证凝胶电泳图。图7为实施例的步骤4中PSK-VPS载体验证结果凝胶电泳图，其中a为菌落PCR结果，b为质粒验证结果，c为质粒验证结果，d为酶切验证结果。图8为实施例的步骤4中PSK-VPS的序列比对结果图。图9为实施例的步骤5中pCAMBIA1301质粒的凝胶电泳图。图10为实施例的步骤5中pCAMBIA1301质粒的酶切验证凝胶电泳图。图11为实施例的步骤5中pCAMBIA1301-VPS载体验证结果凝胶电泳图，其中a为pCAMBIA1301质粒，b为酶切验证结果，c为pCAMBIA1301-Pen3的PCR产物验证结果。对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面结合具体实施例进一步说明本专利技术的技术方案。下述技术方案中，载体pMD19-T、PSK和pCAMBIA的来源分别保存于天津师范大学动植物抗性重点实验室一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法，其步骤如下所述：步骤1：查询得到抗菌肽Penaeidin3a.1的基因序列在GenBank上查询获得Penaeidin3a.1基因序列，GenBank号为AAK73084.1，该基因全长为249bp，序列如下所述(见序列表SEQNO.1)：ATGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTCTTGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTGCCAAGGCCAAGTGTACAAGGGCGGTTACACGCGCCCGATACCCAGGCCACCACCCTTCGTGAGACCTTTGCCAGGAGGGCCTATTGGTCCATACAACGGTTGCCCTGTCTCATGCCGGGGAATTTCCTTCTCACAAGCGCGTTCTTGCTGCTCCCGGTTAGGGCGTTGCTGTCACGTGGGAAAGGGATATTCCGGTTGA步骤2：引物设计依据步骤1中查询得到的Penaeidin3a.1序列设计得到用于扩增Penaeidin3a.1基因(下文中缩写为VPS)的引物并根据pMD19-T质粒载体信息，在引物上添加两种限制性内切酶BglII、PstI的酶切位点及保护碱基，得到的上下游扩增引物如下所述：VPS上游引物：5’-GAAGATCTTCATGCGCCTCGTGGTCTGC-3’(见序列表SEQNO.2)其在5’末端添加有BglⅡ酶的酶切位点及保护碱基：GAAGATCTTC；VPS下游引物：5’-AACTGCAGTCAACCGGAATATCCTTTC-3’(见序列表SEQNO.3)在5’末端添加有PstI酶的酶切位点及保护碱基：AACTGCAG。步骤3：pMD19-T-VPS的构建取凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)组织进行研磨，提取RNA，反转录为cDNA，利用步骤2中得到VPS特异性上下游引物，以凡纳滨对虾cDNA为模板，通过PCR技术获得带有特定酶切位点的VPS基因，并将其连接到pMD19-T上得到pMD19-T-VPS。1)提取RNA具体步骤和反应条件为：RNA提取参考TRNzol说明书(北京天根公司)方法进行，提取试剂由DEPC处理水配制，玻璃及金属器皿在180℃烘干6小时，枪头和离心管等本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法，其特征在于按照下列步骤进行：/n1)取凡纳滨对虾组织进行研磨，提取RNA，反转录为cDNA；/n2)利用VPS特异性引物，以凡纳滨对虾cDNA为模板，通过PCR技术获得带有特定酶切位点的抗菌肽基因，并将其连接到T-载体上；/n3)启动子-VPS-终止子中间载体的构建：对启动子-cTP-终止子中间载体和T-Pen3同时进行双酶切，所采用的限制性内切酶为BglⅡ和Pst I，产物利用T4连接酶进行连接；/n4)最终载体的构建：对启动子-VPS-终止子中间载体和pCAMBIA 1301载体同时进行双酶切，所采用的限制性内切酶为Sac I和EcoR I，对产物利用T4连接酶进行连接获得植物表达凡纳滨对虾VPS的载体。/n

【技术特征摘要】
1.一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法，其特征在于按照下列步骤进行：
1)取凡纳滨对虾组织进行研磨，提取RNA，反转录为cDNA；
2)利用VPS特异性引物，以凡纳滨对虾cDNA为模板，通过PCR技术获得带有特定酶切位点的抗菌肽基因，并将其连接到T-载体上；
3)启动子-VPS-终止子中间载体的构建：对启动子-cTP-终止子中间载体和T-Pen3同时进行双酶切，所采用的限制性内切酶为BglⅡ和PstI，产物利用T4连接酶进行连接；
4)最终载体的构建：对启动子-VPS-终止子中间载体和pCAMBIA1301载体同时进行双酶切，所采用的限制性内切酶为SacI和EcoRI，对产物利用T4连接酶进行连接获得植物表达凡纳滨对虾VPS的载体。

【专利技术属性】
技术研发人员：孙金生，杨琳，曾键尧，李娜，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：天津;12