稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用。本发明专利技术发现MoHXT2编码的转运蛋白接受多种糖作为底物，即MoHXT2基因是稻瘟病菌的己糖转运蛋白，利用CRISPR/Cas9基因敲除系统敲除MoHXT2后，发现其突变体菌丝黑色素含量明显减少，致病性大幅度下降，且根皮苷能对MoHXT2转运己糖产生一定的抑制，从而抑制稻瘟菌的生长。因此，MoHXT2基因可以用于调控植物糖转运功能、调控稻瘟病菌的致病能力和调控稻瘟病菌生长发育，还可以作为新型农药的药物靶标，为合成靶向杀菌剂提供了更可靠的方向。

【技术实现步骤摘要】
稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用
本专利技术属于真菌基因工程领域，特别涉及一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用。
技术介绍
稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)是一个复杂的、异宗配合的子囊菌，它能侵染包括水稻、麦类作物、以及玉米等50多种禾本科植物。在高湿度条件下，稻瘟病菌分生孢子接触水稻叶片后，迅速萌发并产生称为附着胞的特化侵染结构。附着孢通过黑化作用聚集甘油类溶质从而产生高水平的内膨压帮助稻瘟病菌侵入水稻细胞[1]。进入水稻细胞之后，稻瘟病菌开始形成厚球状的初生侵染菌丝，持续3～5天之后才显示症状。稻瘟病菌侵染水稻具体过程如下：1)越冬菌丝萌发产生分生大量的孢子，在风力等介质帮助下最终接触到水稻叶片，此时孢子尖端产生的粘液帮助孢子吸附在叶片表面从而有利于下一步侵染；2)孢子萌发产生芽管，芽管顶端也能产生粘液以便于进一步稳定的吸附在叶片表面；3)形成附着胞，首先在芽管顶端卷曲形成钩状体，紧接着逐渐膨大形成附着胞，附着胞成熟后产生大量黑色素沉积在细胞壁内形成黑色素层，黑色素层有利于细胞内渗透物质本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用，其特征在于，所述的稻瘟病菌基因MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列：/n(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；/n(b)由如SEQ ID NO.2所示的上游同源臂核苷酸序列以及如SEQ ID NO.3所示的下游同源臂核苷酸序列组成的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用，其特征在于，所述的稻瘟病菌基因MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列：
(a)如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；
(b)由如SEQIDNO.2所示的上游同源臂核苷酸序列以及如SEQIDNO.3所示的下游同源臂核苷酸序列组成的序列。


2.根据权利要求1所述的稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用，其特征在于：
所述的植物为水稻；
所述的糖为葡萄糖，半乳糖，甘露糖和果糖中的至少一种。


3.根据权利要求1或2所述的稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用，其特征在于：为通过基因敲除来降低糖转运能力，或通过转入稻瘟病菌基因MoHXT2来恢复或提高糖转运能力；
所述的基因敲除通过如下步骤实现：
(1)利用KpnI酶切pHPT1质粒，得到酶切产物；然后将酶切产物进行脱磷反应后纯化回收，得到pHPT1线性化产物；
(2)将稻瘟病菌基因MoHXT2上游片段连接到pEASY-T1载体上，得到pTA-MGGFlank1；然后使用接头引物Flank3F和Flank3R扩增pTA-MGGFlank1，得到扩增产物I；再用Infusion连接酶连接扩增产物I和步骤(1)中得到的pHPT1线性化产物，转化大肠杆菌，提取质粒，得到质粒pTA-MGGFlank1-hpt；其中，稻瘟病菌基因MoHXT2上游片段的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；接头引物Flank3F和Flank3R的核苷酸序列如SEQIDNO.8～9所示；
(3)利用XhoI酶切步骤(2)中得到的质粒pTA-MGGFlank1-hpt，得到线性化载体pTA-MGGFlank1-hpt；
(4)将稻瘟病菌基因MoHXT2下游片段连接到pEASY-T1载体上，得到pTA-MGGFlank2；然后使用接头引物Flank4F和Flank4R扩增pTA-MGGFlank2，得到扩增产物II；再用Infusion连接酶连接扩增产物II和步骤(3)中得到的线性化载体pTA-MGGFlank1-hpt，转化大肠杆菌，提取质粒，得到质粒pMoHXT2Flank1-hpt-Flank2；其中，稻瘟病菌基因MoHXT2下游片段的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；接头引物Flank4F和Flank4R的核苷酸序列如SEQIDNO.10～11所示；
(5)将Guide-itRecombinantCas9与sgRNA混合后孵育，得到复合物；然后利用CRISPRCas9系统，将复合物和步骤(4)中得到的质粒pMoHXT2Flank1-hpt-Flank2转入稻瘟菌原生质体，再转化真菌，筛选得到基因敲除后的突变体Mohxt2；其中，sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；
步骤(2)所述的扩增产物I和pHPT1线性化产物的摩尔比为1：4～6；
步骤(4)所述的扩增产物II和线性化载体pTA-MGGFlank1-hpt的摩尔比为1：4～6；
所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：林菲，罗晓，徐汉虹，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44