稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用。本发明专利技术发现MoHXT2编码的转运蛋白接受多种糖作为底物，即MoHXT2基因是稻瘟病菌的己糖转运蛋白，利用CRISPR/Cas9基因敲除系统敲除MoHXT2后，发现其突变体菌丝黑色素含量明显减少，致病性大幅度下降，且根皮苷能对MoHXT2转运己糖产生一定的抑制，从而抑制稻瘟菌的生长。因此，MoHXT2基因可以用于调控植物糖转运功能、调控稻瘟病菌的致病能力和调控稻瘟病菌生长发育，还可以作为新型农药的药物靶标，为合成靶向杀菌剂提供了更可靠的方向。

【技术实现步骤摘要】
稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用
本专利技术属于真菌基因工程领域，特别涉及一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用。
技术介绍
稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)是一个复杂的、异宗配合的子囊菌，它能侵染包括水稻、麦类作物、以及玉米等50多种禾本科植物。在高湿度条件下，稻瘟病菌分生孢子接触水稻叶片后，迅速萌发并产生称为附着胞的特化侵染结构。附着孢通过黑化作用聚集甘油类溶质从而产生高水平的内膨压帮助稻瘟病菌侵入水稻细胞[1]。进入水稻细胞之后，稻瘟病菌开始形成厚球状的初生侵染菌丝，持续3～5天之后才显示症状。稻瘟病菌侵染水稻具体过程如下：1)越冬菌丝萌发产生分生大量的孢子，在风力等介质帮助下最终接触到水稻叶片，此时孢子尖端产生的粘液帮助孢子吸附在叶片表面从而有利于下一步侵染；2)孢子萌发产生芽管，芽管顶端也能产生粘液以便于进一步稳定的吸附在叶片表面；3)形成附着胞，首先在芽管顶端卷曲形成钩状体，紧接着逐渐膨大形成附着胞，附着胞成熟后产生大量黑色素沉积在细胞壁内形成黑色素层，黑色素层有利于细胞内渗透物质的积累和膨压的产生，产生的膨压能侵染栓穿透水稻叶片角质层和表皮细胞壁；4)侵染栓能分化形成次生菌丝，菌丝继续生长扩散侵染到相邻的表皮细胞中，并进而深入到叶肉细胞，最终形成大面积的侵染病斑[2-3]。有研究称，稻瘟病菌侵染寄主依赖于稻瘟病菌中的6-P葡萄糖的传感器Tpsl，它可对葡萄糖做出反应，并融合氮源和碳源代谢[5-6]。己糖转运蛋白是一种重要的糖转运蛋白，用于吸收和转运己糖。目前，酿酒酵母己糖载体蛋白的研究比较深入，己鉴定出的有20个己糖载体蛋白，发现酿酒酵母的hxtl-7基因缺失突变体，在葡萄糖、甘露糖、半乳糖和果糖培养基上无法生长，将基因Hxt1，Hxt2，Hxt3，Hxt4，Hxt6，Hxt7和Gal2分别互补hxtl-7基因缺失突变体后，得到著名已经缺陷型酿酒酵母菌株EBY.VW4000，菌株恢复利用葡萄糖的能力[7]。此外，在Neurosporacrcma，Aspergillusnidulans和Colletotrichumgraminicola中也有数个己糖载体蛋白基因被鉴定。全基因扫描发现稻瘟病菌具有66个糖转运蛋白编码基因，而这些基因在稻瘟病菌致病过程中的作用仍然未知[8]。HiromasaSaitoh等首次发现了稻瘟病菌中的一个己糖载体蛋白基因MoST1[4]，MoST1对分生孢子和附着孢的黑化作用起必不可少的作用，暗示了光合产物糖营养的转移和输送也参与了水稻和稻瘟病菌的识别和互作。进化分析表明，在66个己糖转运蛋白样基因中，MGG_01446、MGG_00040和MGG_06203三个基因与MoST1的亲缘关系最为密切，由NCBI数据分析得知MoST1的氨基酸序列与MGG_00040的同源性为31.9％。将其命名为MOHXT2。高等生物通常都有复杂的基因网络来确保细胞内的生物活动有条不紊地进行。真菌的多种性状如致病性、复杂代谢合成途径、重要信号传导途径、重要功能的蛋白复合体等都涉及到了多个基因的共同作用。基因敲除技术是真菌功能基因组研究中必不可少的手段。建立一个核糖核蛋白CRISPR-Cas9(RNP-CRISPR-Cas9)系统，该系统利用纯化的核定位Cas9(Cas9-NLS)和体外合成的sgRNA[9]，当携带可选择标记序列并能修复DSB的供体DNA与RNP共转化为真菌原生质体时[10]，该过程在基因组靶序列上产生高效的稻瘟病菌突变率。传统化学合成杀菌剂不但对环境污染大，还容易造成病原菌抗性的增加，用药成本增高。因此，利用CRISPRCas9基因敲除技术，明确病原菌糖转运蛋白的功能，将病原菌和植物中的糖互作关系运用于病害的控制，有利于生态环境的发展且提高防治效率。参考文献[1].JongJCD.MccormackBJ.SmirnoffN,etal.Glycerolgeneratesturgorinriceblast[J].Nature,1997,389(6648):244-244.[2].DeanR.A.，TalbotN.J.，EbboleD.J.，etal.ThegenomesequenceofthericeblastfungusMagnaporthegrisea.Nature，2005，434:980-986.[3]刘海涛，徐倩，何炜，等.水稻稻瘟病抗性变化及抗性基因克隆的研究进展.福建农业学报，2016，31(5):545-552[4].Saitoh,H.,etal.,MoST1encodingahexosetransporter-likeproteinisinvolvedinbothconidiationandmycelialmelanizationofMagnaportheoryzae.FEMSMicrobiologyLetters,2014.352(1):p.104-113[5].Foster,A.J.；Jenkinson,J.M.；Talbot,N.J.,TrehalosesynthesisandmetabolismarerequiredatdifferentstagesofplantinfectionbyMagnaporthegrisea.TheEMBOJournal2003,22,(2),225-235.[6].Wilson,R.A.；Talbot,N.J.；Littlechild,J.A.；Wang,Z.；Jenkinson,J.M.；Gibson,R.P.,Tps1regulatesthepentosephosphatepathway,nitrogenmetabolismandfungalvirulence.TheEMBOJournal2007，26，(15)，3673-3685.[7].ReifenbergerE,FreidelK,CiriacyM.IdentificationofNovelHxtGenesinSaccharomycescerevisiaeRevealstheImpactofIndividualHexoseTransportersonGlycolyticFlux[J].MolecularMicrobiology,1995,16(1):157-167.[8].许俊洁等,稻瘟病菌中己糖载体蛋白的生物信息学分析.武夷科学,2014.30(00):第187-194页.[9].ChoSW,LeeJ,CarrollD.,etal.HeritableGeneKnockoutinCaenorhabditisElegansbyDirectInjectionofCas9-sgRNARibonucleoproteins[J].Genetics,2013,195.[10].Foster,A.J.,etal.,CRISPR-Cas9ribonucleoprotein-mediatedco-editingandcounterselectionintheric本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用，其特征在于，所述的稻瘟病菌基因MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列：/n(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；/n(b)由如SEQ ID NO.2所示的上游同源臂核苷酸序列以及如SEQ ID NO.3所示的下游同源臂核苷酸序列组成的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用，其特征在于，所述的稻瘟病菌基因MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列：
(a)如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；
(b)由如SEQIDNO.2所示的上游同源臂核苷酸序列以及如SEQIDNO.3所示的下游同源臂核苷酸序列组成的序列。


2.根据权利要求1所述的稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用，其特征在于：
所述的植物为水稻；
所述的糖为葡萄糖，半乳糖，甘露糖和果糖中的至少一种。


3.根据权利要求1或2所述的稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用，其特征在于：为通过基因敲除来降低糖转运能力，或通过转入稻瘟病菌基因MoHXT2来恢复或提高糖转运能力；
所述的基因敲除通过如下步骤实现：
(1)利用KpnI酶切pHPT1质粒，得到酶切产物；然后将酶切产物进行脱磷反应后纯化回收，得到pHPT1线性化产物；
(2)将稻瘟病菌基因MoHXT2上游片段连接到pEASY-T1载体上，得到pTA-MGGFlank1；然后使用接头引物Flank3F和Flank3R扩增pTA-MGGFlank1，得到扩增产物I；再用Infusion连接酶连接扩增产物I和步骤(1)中得到的pHPT1线性化产物，转化大肠杆菌，提取质粒，得到质粒pTA-MGGFlank1-hpt；其中，稻瘟病菌基因MoHXT2上游片段的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；接头引物Flank3F和Flank3R的核苷酸序列如SEQIDNO.8～9所示；
(3)利用XhoI酶切步骤(2)中得到的质粒pTA-MGGFlank1-hpt，得到线性化载体pTA-MGGFlank1-hpt；
(4)将稻瘟病菌基因MoHXT2下游片段连接到pEASY-T1载体上，得到pTA-MGGFlank2；然后使用接头引物Flank4F和Flank4R扩增pTA-MGGFlank2，得到扩增产物II；再用Infusion连接酶连接扩增产物II和步骤(3)中得到的线性化载体pTA-MGGFlank1-hpt，转化大肠杆菌，提取质粒，得到质粒pMoHXT2Flank1-hpt-Flank2；其中，稻瘟病菌基因MoHXT2下游片段的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；接头引物Flank4F和Flank4R的核苷酸序列如SEQIDNO.10～11所示；
(5)将Guide-itRecombinantCas9与sgRNA混合后孵育，得到复合物；然后利用CRISPRCas9系统，将复合物和步骤(4)中得到的质粒pMoHXT2Flank1-hpt-Flank2转入稻瘟菌原生质体，再转化真菌，筛选得到基因敲除后的突变体Mohxt2；其中，sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；
步骤(2)所述的扩增产物I和pHPT1线性化产物的摩尔比为1：4～6；
步骤(4)所述的扩增产物II和线性化载体pTA-MGGFlank1-hpt的摩尔比为1：4～6；
所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：林菲，罗晓，徐汉虹，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44