本发明专利技术公开一种获得具有生物学活性的RANKL重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）RANKL重组蛋白通过体外诱导大量表达；（2）通过纯化获得具有生物学活性的RANKL重组蛋白；（3）通过RANKL重组蛋白在体外促进破骨细胞的分化对其生物学活性进行鉴定的过程。本发明专利技术还公开一种具有生物学活性的RANKL重组蛋白在制备治疗骨代谢异常疾病药物中的应用，其特征在于，所述具有生活学活性的RANKL重组蛋白通过RANKL重组蛋白体外诱导表达、纯化及鉴定的方法获得；本发明专利技术提示了通过体外诱导表达及纯化RANKL重组蛋白来获取大量具有生物学活性的RANKL重组蛋白，有潜力成为用于治疗和改善骨硬化症及尖周肉牙肿病新途径。
【技术实现步骤摘要】
一种获得具有生物学活性的RANKL重组蛋白的方法及其应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种获得具有生物学活性的RANKL重组蛋白的方法及其应用。
技术介绍
目前传统药物或显微外科手术对于骨硬化症及尖周肉牙肿的治疗已取得一定效果，但对于常染色体异常引起的骨硬化症严重的病人治疗效果不佳，其主要是由于骨代谢过程中破骨细胞的骨吸收功能受到抑制。研究表明RANKL能够促进破骨细胞分化，增强骨吸收功能。骨代谢疾病的发生大多由于成骨细胞介导的骨形成过程和破骨细胞介导的骨吸收过程异常密切相关，因此，如何获得生物学活性的RANKL重组蛋白是本专利技术所需要解决的问题。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种获得具有生物学活性的RANKL重组蛋白的方法及其应用。为解决上述技术问题，本专利技术的实施例提供一种获得具有生物学活性的RANKL重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）RANKL重组蛋白通过体外诱导大量表达；（2）通过纯化获得具有生物学活性的RANKL重组蛋白；（3）通过RANKL重组蛋白在体外促进破骨细胞的分化，对其生物学活性进行鉴定的过程。进一步的，所述步骤（1）中的RANKL重组蛋白通过体外诱导大量表达，具体包括以下过程：（1-1）RANKL重组蛋白的诱导表达（1-1-1）将含有pET-32a-mRANKL重组质粒的BL21感受态细胞进行复苏，接种于0.5ml含有Amp抗性的LB培养基中；37℃，150rpm摇菌培养过夜，取10ul菌液均匀铺板于LB固态培养板中，37℃培养过夜；（1-1-2）选择单克隆菌落进行平板挑菌，接种于5ml含有Amp抗性的LB培养基中37℃，150rpm摇菌，培养过夜，按照1:100接种于500ml含有Amp抗性的LB培养基中，37℃，250rpm摇菌至OD在0.4-0.6之间，加入IPTG诱导5h，提取菌液蛋白；（1-2）RANKL重组蛋白的提取（1-2-1）3000rpm离心5min，收集细菌，弃上清，加入PBS重悬后，3000rpm离心5min，收集细菌，弃上清，加入200ulPBS，超声裂解细菌，12000rpm离心10min，将上清转移至另一个新的1.5ml离心管中；（1-2-2）用200ulPBS重悬沉淀，用Nanodrop测定菌液上清与沉淀的蛋白浓度，调整一致后，加入6×SDS-PAGEloadingbuffer沸水浴中10min，-80℃保存；（1-3）SDS-PAGE鉴定RANKL重组蛋白（1-3-1）通过10%的SDS-PAGE胶进行电泳，按照对照上清蛋白样本，对照沉淀蛋白样本，RANKL重组蛋白上清样本及RANKL重组蛋白沉淀样本的顺序上样，每个泳道40ug蛋白；（1-3-2）120V，90min后，进行考马斯亮蓝G-250染色，摄片。进一步的，所述步骤（2）中通过纯化获得具有生物学活性的RANKL重组蛋白，具体包括以下过程：（2-1）RANKL重组蛋白的纯化（2-1-1）将提取的RANKL重组蛋白通过His标签进行纯化，即RANKL重组蛋白在设计时加入了一段含有6个组氨酸的肽段；（2-2）SDS-PAGE鉴定纯化后的RANKL重组蛋白（2-2-1）通过10%的SDS-PAGE胶进行电泳，按照纯化后对照上清蛋白样本，纯化后对照沉淀蛋白样本，纯化后RANKL重组蛋白上清样本及纯化后RANKL重组蛋白沉淀样本的顺序上样，每个泳道40ug蛋白；（2-2-2）120V，90min后，进行考马斯亮蓝G-250染色；（2-3）Westernblot鉴定纯化后的RANKL重组蛋白（2-3-1）SDS-PAGE电泳结束后进行转膜，将聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白样本转移至硝酸纤维素膜（NC膜）上，80V60min；（2-3-2）将NC膜置于5%的脱脂乳溶液中室温封闭2h，加入一抗anti-RANKL（1:1000）4℃孵育过夜；（2-3-3）0.05%TBST溶液清洗6×5min后，加入二抗anti-rabbit（1:5000）室温孵育2h；（2-3-4）ECL显色摄片。进一步的，所述步骤（3）中，通过RANKL重组蛋白在体外促进破骨细胞的分化对其生物学活性进行鉴定的过程，具体包括以下过程：（3-1）RANKL重组蛋白诱导破骨细胞前体Raw264.7细胞分化形成破骨细胞（3-1-1）将Raw264.7细胞接种于96孔细胞培养板中，1万个/孔，培养于10%胎牛血清（FBS）的α-MEM培养基中，加入50ng/mlRANKL重组蛋白，37℃，5%CO2饱和湿度下诱导5-6天，形成破骨细胞；（3-1-2）通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒进行染色，摄片；（3-2）RANKL重组蛋白诱导骨髓巨噬细胞（BMM）分化形成破骨细胞（3-2-1）取5-8周龄雄性BALB/c小鼠，麻醉处死，无菌分离胫骨及股骨，用注射器反复冲洗骨髓腔直至骨髓腔发白，过滤离心后，用红细胞裂解液去除红细胞，PBS洗一遍，用含有30ng/ml巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的α-MEM培养基重悬，接种于培养皿中，24h后收集未贴壁细胞，接种于培养皿中，同时加入30ng/mlM-CSF培养3d，获得骨髓巨噬细胞BMM；（3-2-2）将BMM接种于96孔板中同时加入30ng/mlM-CSF和100ng/mlRANKL重组蛋白诱导6-6天形成破骨细胞；（3-2-3）通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒进行染色，摄片。本专利技术的实施例还提供一种具有生物学活性的RANKL重组蛋白在制备治疗骨代谢异常疾病药物中的应用，所述具有生活学活性的RANKL重组蛋白通过RANKL重组蛋白体外诱导表达、纯化及鉴定的方法获得。进一步的，所述疾病包括骨硬化症及尖周肉牙肿病。本专利技术的上述技术方案的有益效果如下：本专利技术基于重组蛋白的体外诱导表达技术，体外获取大量RANKL重组蛋白，进一步通过纯化RANKL重组蛋白来获取大量具有生物学活性的RANKL重组蛋白，再进一步通过将RANKL重组蛋白用于体外诱导破骨细胞的分化中，明确本专利技术所获得的RANKL重组蛋白具有较好的生物学活性，本专利技术提示了通过体外诱导表达及纯化RANKL重组蛋白来获取大量具有生物学活性的RANKL重组蛋白，有潜力成为用于治疗和改善骨硬化症及尖周肉牙肿病新途径。本专利技术目前主要在体外诱导小鼠RANKL重组蛋白的表达、纯化及活性的初步鉴定，后期将重组蛋白的生物学活性在大动物及非人灵长类动物中进一步研究其治疗骨硬化症及尖周肉牙肿的效果。附图说明图1为本专利技术的实施例1中RANKL重组蛋白的诱导表达中RANKL重组蛋白及对照样本的上清及沉淀样本，变性后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，考马斯亮蓝染色图；图中框线内为RANKL重组蛋白，M为标准蛋白marker；泳道1为对照样本蛋白上清本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种获得具有生物学活性的RANKL重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）RANKL重组蛋白通过体外诱导大量表达；（2）通过纯化获得具有生物学活性的RANKL重组蛋白；（3）通过RANKL 重组蛋白在体外促进破骨细胞的分化，对其生物学活性进行鉴定的过程。/n
【技术特征摘要】
1.一种获得具有生物学活性的RANKL重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）RANKL重组蛋白通过体外诱导大量表达；（2）通过纯化获得具有生物学活性的RANKL重组蛋白；（3）通过RANKL重组蛋白在体外促进破骨细胞的分化，对其生物学活性进行鉴定的过程。
2.根据权利要求1所述的一种获得具有生物学活性的RANKL重组蛋白的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的RANKL重组蛋白通过体外诱导大量表达，具体包括以下过程：
（1-1）RANKL重组蛋白的诱导表达
（1-1-1）将含有pET-32a-mRANKL重组质粒的BL21感受态细胞进行复苏，接种于0.5ml含有Amp抗性的LB培养基中；37℃，150rpm摇菌培养过夜，取10ul菌液均匀铺板于LB固态培养板中，37℃培养过夜；
（1-1-2）选择单克隆菌落进行平板挑菌，接种于5ml含有Amp抗性的LB培养基中37℃，150rpm摇菌，培养过夜，按照1:100接种于500ml含有Amp抗性的LB培养基中，37℃，250rpm摇菌至OD在0.4-0.6之间，加入IPTG诱导5h，提取菌液蛋白；
（1-2）RANKL重组蛋白的提取
（1-2-1）3000rpm离心5min，收集细菌，弃上清，加入PBS重悬后，3000rpm离心5min，收集细菌，弃上清，加入200ulPBS，超声裂解细菌，12000rpm离心10min，将上清转移至另一个新的1.5ml离心管中；
（1-2-2）用200ulPBS重悬沉淀，用Nanodrop测定菌液上清与沉淀的蛋白浓度，调整一致后，加入6×SDS-PAGEloadingbuffer沸水浴中10min，-80℃保存；
（1-3）SDS-PAGE鉴定RANKL重组蛋白
（1-3-1）通过10%的SDS-PAGE胶进行电泳，按照对照上清蛋白样本，对照沉淀蛋白样本，RANKL重组蛋白上清样本及RANKL重组蛋白沉淀样本的顺序上样，每个泳道40ug蛋白；
（1-3-2）120V，90min后，进行考马斯亮蓝G-250染色，摄片。
3.根据权利要求1所述的一种获得具有生物学活性的RANKL重组蛋白的方法，其特征在于，所述步骤（2）中通过纯化获得具有生物学活性的RANKL重组蛋白，具体包括以下过程：
（2-1）RANKL重组蛋白的纯化
（2-1-1）将提取的RANKL重组蛋白通过His标签进行纯化，即RANKL重组蛋白在设计时加入了一段含有6个组氨酸的肽段；
（2-2）SDS-PAGE鉴定纯化后的RANKL重组蛋白
（2-2-1）通过10%的SDS-PAGE胶进行电泳，按照纯化后对照上清蛋白样本，纯化后对照沉淀蛋白样本...
【专利技术属性】
技术研发人员：王东，闵雯嫣，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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