一种拟南芥hsd1/2/3/4/5/6六突变体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种拟南芥hsd1/2/3/4/5/6六突变体及其构建方法和应用，属于基因编辑和分子育种技术领域。本发明专利技术根据HSD基因HSD2/3，HSD1/4/6在染色体上紧密连锁的位置关系，利用CRISPR/Cas9技术及传统的T‑DNA插入、杂交技术相结合的方法可以在较短时间内达到精确、有效地敲除全部HSD基因的多突变体，为后续研究HSD基因家族的功能奠定坚实基础。

Construction and application of a six mutant HSD1 / 2 / 3 / 4 / 5 / 6 in Arabidopsis thaliana

【技术实现步骤摘要】
一种拟南芥hsd1/2/3/4/5/6六突变体及其构建方法和应用
本专利技术属于基因编辑和分子育种
，具体涉及一种拟南芥hsd1/2/3/4/5/6六突变体及其构建方法和应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。油体是细胞中的贮油细胞器，其包含的三酰甘油等为种子萌发及植株早期生长提供重要的能源和碳源。羟化类固醇脱氢酶(hydroxysteroiddehydrogenase，HSD)是油体表面的固醇油质蛋白，对于调节生长发育、调控叶表皮蜡质合成及脂肪酸代谢、促进或调节BR的作用及盐胁迫应答具有重要作用，但具体调控机制并不清楚。本方法以拟南芥的HSD基因家族为对象，利用CRISPR技术传统的杂交方法相结合获得敲除全部HSD基因的6突变体，为后续对HSD的功能进行深入研究奠定基础，有重要的理论意义及实际应用价值。目前最常用的研究基因功能的方法之一是敲除该基因，T-DNA插入植物基因组是获得突变体的途径本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种拟南芥hsd1/2/3/4/5/6六突变体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：/n(1)T-DNA插入获得拟南芥hsd2和hsd5单突变纯合株系；/n(2)CRISPR基因编辑技术构建hsd1/4及hsd2/3双突变体纯合株系；/n(3)采用杂交方法构建hsd1/4/5三突变体纯合株系；/n(4)采用杂交方法构建hsd1/2/3/4/5五突变体纯合株系；/n(5)CRISPR基因编辑技术构建hsd1/2/3/4/5/6六突变体纯合株系。/n

【技术特征摘要】
1.一种拟南芥hsd1/2/3/4/5/6六突变体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
(1)T-DNA插入获得拟南芥hsd2和hsd5单突变纯合株系；
(2)CRISPR基因编辑技术构建hsd1/4及hsd2/3双突变体纯合株系；
(3)采用杂交方法构建hsd1/4/5三突变体纯合株系；
(4)采用杂交方法构建hsd1/2/3/4/5五突变体纯合株系；
(5)CRISPR基因编辑技术构建hsd1/2/3/4/5/6六突变体纯合株系。


2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：
从美国拟南芥种质资源库获得HSD2、HSD5T-DNA插入突变体的种子，鉴定T-DNA插入突变体植株的纯杂合情况，筛选获得拟南芥hsd2和hsd5单突变纯合株系。


3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，鉴定T-DNA插入突变体植株的纯杂合情况方法为：提取拟南芥单株DNA后，设计引物进行扩增，判断突变体植株的纯杂合情况。


4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对拟南芥HSD1和HSD4基因同时进行编辑，在hsd2突变体基础上对HSD3基因进行编辑，经潮霉素筛选，PCR扩增以及酶切检测，获得hsd1/4和hsd2/3纯合突变体株系，经PCR及潮霉素筛选验证，得到无Cas9背景的纯合的hsd1/4及hsd2/3株系。


5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，
针对基因AtHSD1第2个外显子设计的sgRNA序列为SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵群，马长乐，王光禄，刘晓凡，杨贤鹏，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37