一种拟南芥hsd1/2/3/4/5/6六突变体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种拟南芥hsd1/2/3/4/5/6六突变体及其构建方法和应用，属于基因编辑和分子育种技术领域。本发明专利技术根据HSD基因HSD2/3，HSD1/4/6在染色体上紧密连锁的位置关系，利用CRISPR/Cas9技术及传统的T‑DNA插入、杂交技术相结合的方法可以在较短时间内达到精确、有效地敲除全部HSD基因的多突变体，为后续研究HSD基因家族的功能奠定坚实基础。

Construction and application of a six mutant HSD1 / 2 / 3 / 4 / 5 / 6 in Arabidopsis thaliana

【技术实现步骤摘要】
一种拟南芥hsd1/2/3/4/5/6六突变体及其构建方法和应用
本专利技术属于基因编辑和分子育种
，具体涉及一种拟南芥hsd1/2/3/4/5/6六突变体及其构建方法和应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。油体是细胞中的贮油细胞器，其包含的三酰甘油等为种子萌发及植株早期生长提供重要的能源和碳源。羟化类固醇脱氢酶(hydroxysteroiddehydrogenase，HSD)是油体表面的固醇油质蛋白，对于调节生长发育、调控叶表皮蜡质合成及脂肪酸代谢、促进或调节BR的作用及盐胁迫应答具有重要作用，但具体调控机制并不清楚。本方法以拟南芥的HSD基因家族为对象，利用CRISPR技术传统的杂交方法相结合获得敲除全部HSD基因的6突变体，为后续对HSD的功能进行深入研究奠定基础，有重要的理论意义及实际应用价值。目前最常用的研究基因功能的方法之一是敲除该基因，T-DNA插入植物基因组是获得突变体的途径之一，其整合的拷贝数较低，被插入的基因在后代中能够稳定遗传，但其插入位点是随机的，不能精准突变某个目的基因。RNAi方法是敲除基因常用的技术，是指双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)分子引起的序列特异性降解靶基因信使RNA(mRNA)，从而导致内源靶基因沉默。RNAi方法具有不完全敲除、临时性且特异性差的特点，确定基因的精确功能比较困难，结果有限而且难以完全令人信服。而且对基因家族而言，敲除一个或几个基因后，其他成员可能会补偿其作用，所以把家族所有成员都敲除掉才有可能真正揭示其功能。拟南芥HSD是一个大家族，包括8个成员，其基因组中有HSD1的5个同源基因HSD2、HSD3、HSD4、HSD5、HSD6，只敲除一个基因，难以弄清楚HSD家族各成员及整个基因家族的确切功能。然而迄今为止，研究仅限于AtHSD1，而且只进行了过量表达及RNAi突变株系的初步研究，结果证明AtHSD1对于调节植物生长发育具有重要作用，而且可能促进或调节BR的作用，对于提高油菜或其他农作物的生长及产量具有重要的潜在价值。由于RNAi方法的局限性，结果难以完全令人信服，RNAi突变株系中其他HSD基因的表达也未提供相关的数据。还有很多问题值得深入研究，如此酶的底物还没找到，HSDs对于植物生长发育的调控机制还不清楚，HSDs在蜡质合成中的作用机制也不清楚，HSD与BR之间的关系也没有清晰的线索。拟南芥基因组中发现的6个HSD基因分别位于第Ⅲ、第Ⅳ及第Ⅴ染色体上，其中HSD2、HSD3在第Ⅲ染色体上紧密连锁，HSD1、HSD4、HSD6在第Ⅴ染色体上紧密连锁，得到单基因敲除的突变体相对容易，但由于缺乏有效可行的技术手段，利用RNAi、T-DNA插入技术及传统杂交方法同时敲除紧密连锁的HSD基因非常困难，敲除全部6个基因几乎不可能，这也许是其他HSD成员及整个基因家族功能的研究还未见报道的主要原因。近年来，基因组编辑技术为生物学研究开辟了新的研究途径，成为研究基因功能的重要方法该方法主要依赖人工内切核酸酶(SSNs)在目标基因组位置产生双链断裂(DSBs)，DSBs可以通过非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HDR)进行修复。通过NHEJ的修复容易发生错误，使断裂位置产生小片段的缺失或插入，从而导致基因突变。目前在植物中应用的基因组编辑技术包括锌指核酸酶(Zinc-fingernucleases，ZFNs)、类转录因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs)、巨核酶(Meganucleases)、成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associated9，CRISPR/Cas9system)和CRISPR/Cpf1，其中由于CRISPR系统其打靶准确性极高、脱靶率较低，在这些基因组编辑技术中脱颖而出。CRISPR/Cas9系统主要由主要包括CRISPRassociated9蛋白(Cas9)和2个非编码的前导RNA[CRISPRRNAs(crRNAs)]，即trans-activatingcrRNA(tracrRNA)和crRNA前体(precrRNA)。tracrRNA与crRNA配对形成的二聚体通过对PAM序列的识别，引导Cas9蛋白在距离PAM位点3～8个碱基的位置对目标序列进行精准剪切，达到精确修饰基因组的目的，并且能够更为迅速地改变或删除细胞中的多个基因，为研究基因家族的功能提供了便捷、迅速、高效、可行的技术手段。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种拟南芥hsd1/2/3/4/5/6六突变体及其构建方法和应用。本专利技术利用CRISPR/Cas9系统、T-DNA插入技术及传统的杂交技术相结合从而成功获得敲除全部6个HSD基因的拟南芥六突变体hsd1/2/3/4/5/6。为实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术的第一个方面，提供一种拟南芥hsd1/2/3/4/5/6六突变体的构建方法，所述构建方法包括：(1)T-DNA插入获得拟南芥hsd2和hsd5单突变纯合株系；(2)CRISPR基因编辑技术构建hsd1/4及hsd2/3双突变体纯合株系；(3)采用杂交方法构建hsd1/4/5三突变体纯合株系；(4)采用杂交方法构建hsd1/2/3/4/5五突变体纯合株系；(5)CRISPR基因编辑技术构建hsd1/2/3/4/5/6六突变体纯合株系。其中，所述步骤(1)具体为：从美国拟南芥种质资源库(ABRC)获得HSD2、HSD5T-DNA插入突变体的种子，鉴定T-DNA插入突变体植株的纯杂合情况，筛选获得拟南芥hsd2和hsd5单突变纯合体。具体的，鉴定T-DNA插入突变体植株的纯杂合情况方法为：提取拟南芥单株DNA后，设计引物进行扩增，判断突变体植株的纯杂合情况。所述步骤(2)具体为：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对拟南芥HSD1和HSD4基因同时进行编辑，在hsd2突变纯合体基础上对HSD3基因进行编辑，经潮霉素筛选，PCR扩增以及酶切检测，获得hsd1/4和hsd2/3纯合突变体株系，经PCR及潮霉素筛选验证，得到无Cas9背景的纯合的hsd1/4及hsd2/3株系。其中，针对基因AtHSD1第2个外显子设计的sgRNA序列为CCGAAGGAAGAACCGTCTAGAGG(SEQIDNO.1)；针对基因AtHSD4第2个外显子设计的sgRNA序列为：GCTGACCGGTGCAGGAAGCTTGG(SEQIDNO.2)；针对基因AtHSD3第3个外显子设计的sgRNA序列为：CCTGATCAATAATGCTGGTGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种拟南芥hsd1/2/3/4/5/6六突变体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：/n(1)T-DNA插入获得拟南芥hsd2和hsd5单突变纯合株系；/n(2)CRISPR基因编辑技术构建hsd1/4及hsd2/3双突变体纯合株系；/n(3)采用杂交方法构建hsd1/4/5三突变体纯合株系；/n(4)采用杂交方法构建hsd1/2/3/4/5五突变体纯合株系；/n(5)CRISPR基因编辑技术构建hsd1/2/3/4/5/6六突变体纯合株系。/n

【技术特征摘要】
1.一种拟南芥hsd1/2/3/4/5/6六突变体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
(1)T-DNA插入获得拟南芥hsd2和hsd5单突变纯合株系；
(2)CRISPR基因编辑技术构建hsd1/4及hsd2/3双突变体纯合株系；
(3)采用杂交方法构建hsd1/4/5三突变体纯合株系；
(4)采用杂交方法构建hsd1/2/3/4/5五突变体纯合株系；
(5)CRISPR基因编辑技术构建hsd1/2/3/4/5/6六突变体纯合株系。


2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：
从美国拟南芥种质资源库获得HSD2、HSD5T-DNA插入突变体的种子，鉴定T-DNA插入突变体植株的纯杂合情况，筛选获得拟南芥hsd2和hsd5单突变纯合株系。


3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，鉴定T-DNA插入突变体植株的纯杂合情况方法为：提取拟南芥单株DNA后，设计引物进行扩增，判断突变体植株的纯杂合情况。


4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对拟南芥HSD1和HSD4基因同时进行编辑，在hsd2突变体基础上对HSD3基因进行编辑，经潮霉素筛选，PCR扩增以及酶切检测，获得hsd1/4和hsd2/3纯合突变体株系，经PCR及潮霉素筛选验证，得到无Cas9背景的纯合的hsd1/4及hsd2/3株系。


5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，
针对基因AtHSD1第2个外显子设计的sgRNA序列为SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵群，马长乐，王光禄，刘晓凡，杨贤鹏，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37