一种提高苹果愈伤镉敏感性的方法技术

本发明专利技术涉及一种提高苹果愈伤镉敏感性的方法，具体涉及将MhNRAMP6基因在苹果愈伤中超表达，MhNRAMP6基因的开放阅读框(ORF)长度为1638bp，编码含有545个氨基酸的蛋白，预测其蛋白质分子量为59.12kD，定位于质膜，并具有11个强跨膜螺旋；其核苷酸序列如SEQ No.1所示。含超表达基因MhNRAMP6的苹果愈伤镉敏感性更强，进而降低了苹果愈伤的耐镉性，避免了由于果园重金属Cd污染加剧，导致果树产生各种胁迫反应，影响果实产量和品质的问题。

A method for improving cadmium sensitivity of Apple callus

【技术实现步骤摘要】
一种提高苹果愈伤镉敏感性的方法
本专利技术涉及一种提高苹果愈伤镉敏感性的方法，属于镉对苹果生长影响的研究领域。
技术介绍
镉(Cadmium，Cd)是具有较强毒性的重金属，较低浓度即可抑制植物生长。经长期吸收积累就会促进植物细胞产生大量活性氧，促使蛋白质变性、失活，进而破坏植物细胞膜，造成细胞内部结构损伤，破坏细胞代谢平衡，引起叶片出现斑点降低光合作用效率，导致植株生长缓慢、植株矮小，甚至引发植物病变和死亡，最终影响作物产量和品质(陈爱葵等，2013；马艳华等，2014)。随着工业化发展，水源的污染、废气的排放等已经造成我国部分用于农业产生的土壤镉含量严重超标，有的区域甚至达到124mgkg-1(Yuanetal.,2016)。许多果园的土壤也已经被镉污染，严重威胁着果品安全(Chengetal.,2015)。水果和农作物可食用部分中的镉以食物链传递的方式一级一级在人体富集，对人的身体健康造成危害。镉会引起心脑血管疾病，导致高血压和心血管的扩张，还会抑制血红蛋白的合成，干扰微量元素吸收，造成肾脏功能受损害和肺部受伤害；镉还会破坏骨钙，如果长期摄入镉则会造成骨质疏松甚至脊柱畸形等问题，对生殖系统也会产生不可逆的损害，比如“痛骨病”就是一种因镉污染造成的疾病(Akessonetal，2014；张佳，2016)。苹果作为全球四大水果之一，我国苹果产量和栽培面积均居世界之首。栽培苹果主要利用砧木进行嫁接繁殖(Zhou等，2016)，砧木作为苹果生产的承接者，能够调节地上部的生长发育，提高果品的产量和品质。平邑甜茶是我国原产的宝贵紧缺的优良苹果砧木资源，其根系发达，具有极强的耐涝、耐寒和抗病能力，适应性极强。通过调节砧木根系的镉吸收能力，对于改善果树地上部生长发育及果品安全问题具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术针对上述问题，提供了一种提高苹果愈伤镉敏感性的方法，本专利技术利用超表达基因MhNRAMP6提高了苹果愈伤的镉敏感性，降低了其耐镉性。专利技术人利用同源克隆和PCR技术从平邑甜茶根系中分离出一个MhNRAMP(自然抗性相关巨噬细胞蛋白)基因，它的开放阅读框(ORF)长度为1638bp，编码含有545个氨基酸的蛋白，预测其蛋白质分子量为59.12kD，定位于质膜，并具有11个强跨膜螺旋，推测其可能为跨膜蛋白。MhNRAMP6与苹果的MdNRAMP6的同源性最高，高达99.08％，该基因命名为MhNRAMP6，其核苷酸序列如SEQNo.1所示。本专利技术的技术方案如下：一种提高苹果愈伤镉敏感性的方法，将MhNRAMP6基因在苹果愈伤中超表达。具体步骤如下：(1)利用带有酶切位点的特异性引物进行PCR扩增pMD18-T-MhNRAMP6，产物与pROKII重组并构建了含MhNRAMP6基因的植物过表达载体pROKII-MhNRAMP6，转化农杆菌GV3101，获得带目的片段的表达载体的阳性菌株；特异性引物及酶切位点为：F:CGGGAATGGCTGTGGCCAGTACGG(BamHI)；R：GGGGTAGGTCTACCGAAAATATCGA(KpnI)；(2)将阳性菌株浸染苹果愈伤，苹果愈伤再通过含有30mg/L的卡那霉素和250mg/L的头孢霉素的MS固体培养基培养，然后利用PCR技术获得MhNRAMP6基因超表达的苹果愈伤。超表达MhNRAMP6基因能够提高苹果愈伤组织对镉的吸收速度，增加苹果愈伤内镉的积累，提高苹果愈伤镉敏感性。本专利技术与现有技术相比具有以下优点：本专利技术将MhNRAMP6基因在苹果愈伤中超表达，经过实验证明超表达MhNRAMP6基因的苹果愈伤镉敏感性更强，进而降低了苹果愈伤的耐镉性，避免了由于果园重金属Cd污染加剧，导致果树产生各种胁迫反应，影响果实产量和品质的问题。附图说明图1为镉处理下转MhNRAMP6和野生型酵母生长情况；图2为5μMCdSO4处理条件下酵母的生长曲线；图3为转MhNRAMP6和野生型酵母生长84h后的镉含量；图4为转基因苹果愈伤中MhNRAMP6基因的PCR电泳图；图5为转基因苹果愈伤中MhNRAMP6的表达分析；图6为野生型和MhNRAMP6转基因苹果愈伤在镉处理条件下的生长表型；图7a为镉处理条件下野生型和MhNRAMP6转基因苹果愈伤的鲜重柱形图；图7b为镉处理条件下野生型和MhNRAMP6转基因苹果愈伤的相对电导率；图8为超表达MhNRAMP6苹果愈伤对Cd2+流速影响的柱形图；图9为野生型和MhNRAMP6转基因苹果愈伤的镉荧光染色；图10为野生型和MhNRAMP6转基因苹果愈伤的镉含量。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例：一种提高苹果愈伤镉敏感性的方法将MhNRAMP6基因在苹果愈伤中超表达，MhNRAMP6基因的开放阅读框(ORF)长度为1638bp，编码含有545个氨基酸的蛋白，预测其蛋白质分子量为59.12kD，定位于质膜，并具有11个强跨膜螺旋；其核苷酸序列如SEQNo.1所示。具体方法如下：(1)利用带有酶切位点的特异性引物进行PCR扩增pMD18-T-MhNRAMP6，产物与pROKII重组并构建了含MhNRAMP6基因的植物过表达载体pROKII-MhNRAMP6，转化农杆菌GV3101，获得带目的片段的表达载体的阳性菌株；特异性引物及酶切位点为：F:CGGGAATGGCTGTGGCCAGTACGG(BamHI)；R：GGGGTAGGTCTACCGAAAATATCGA(KpnI)；(2)将阳性菌株浸染野生型苹果愈伤，苹果愈伤再通过含有30mg/L的卡那霉素和250mg/L的头孢霉素的MS固体培养基培养，然后利用PCR技术获得MhNRAMP6基因超表达的苹果愈伤，即对镉具有更强敏感性的苹果愈伤。实验例1试验材料1.1苹果愈伤材料与处理试验在山东农业大学温室和果树生物学重点实验室进行。苹果愈伤组织：黑暗条件和温度25℃下培养，每两周继代一次。愈伤组织固体培养基为：MS固体基本培养基加入1.6mgL-12,4-D和0.4mgL-16-BA。选取生长良好的愈伤组织，于50μMCdSO4处理15天。1.2菌株及载体本试验采用的菌株：大肠杆菌(Escherichiacoli)为Trans5α，农杆菌为LBA4404，均购自北京全式金生物科技(TRANS)公司。酵母菌株为BY4741，市售。1.3酶、试剂盒及引物限制性内切酶、EasyTaq酶、TransTaqHiFiDNAPolymerase购自北京全本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高苹果愈伤镉敏感性的方法，其特征在于，将MhNRAMP6基因在苹果愈伤中超表达，MhNRAMP6基因的核苷酸序列如SEQ No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高苹果愈伤镉敏感性的方法，其特征在于，将MhNRAMP6基因在苹果愈伤中超表达，MhNRAMP6基因的核苷酸序列如SEQNo.1所示。


2.根据权利要求1所述提高苹果愈伤镉敏感性的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)利用带有酶切位点的特异性引物进行PCR扩增pMD18-T-MhNRAMP6，产物与pROKII重组并构建了含MhNRAMP6基因的植物过表达载体pROKII-MhNRA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玮玮，岳松青，宋建飞，荀咪，杨洪强，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37