一种热诱导的基因编辑系统CRISPR-Cas12b在陆地棉中的应用技术方案

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种热诱导的基因编辑系统CRISPR‑Cas12b首次在陆地棉中的应用。对含有棉花内源启动子pGhU6‑7的pRGEB32‑GhU6.7‑NPT Ⅱ载体进行改造，以密码子优化合成的AaCas12b蛋白取代原Cas9蛋白，构建棉花中具有编辑能力的载体。选取GhCLA为目标基因验证载体在棉花中的应用。设计2个靶标，利用农杆菌介导的转化将Cas12b编辑系统导入棉花基因组，使用三种温度不同时间处理下胚轴，转基因植株进行相关测序，检测异源四倍体棉花基因组中的编辑效率和全基因组检测脱靶效应。本发明专利技术使用特定的温度和处理时间得到良好的编辑效率和特异性。

【技术实现步骤摘要】
一种热诱导的基因编辑系统CRISPR-Cas12b在陆地棉中的应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种热诱导的基因编辑系统CRISPR-Cas12b在陆地棉中的应用。包括陆地棉的转化载体的构建，通过探索特定的处理温度和时间，利用构建的载体在陆地棉功能基因组中进行精准编辑。
技术介绍
2013年，科学家们在细菌和古生菌中发现了成簇规律间隔短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR)和CRISPR相关Cas蛋白质(CRISPR/Cas)构成适应性免疫系统来防止噬菌体和病毒入侵，细菌的CRISPR/Cas系统可降解入侵的病毒或质粒DNA来保护自己(Bolotinetal.,2005；Jansenetal.,2002；Mojicaetal.,2005；Pourceletal.,2005)。该系统已经在动植物微生物中得到广泛的应用(Jiangetal.,2013；Lietal.,2013；Wangetal.,2014)。CRISPR/Cas9本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够对陆地棉基因组5'-TTN-3'碱基位点精确识别并能产生长黏性末端的高效转化载体GhC12B，其特征在于，该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种能够对陆地棉基因组5'-TTN-3'碱基位点精确识别并能产生长黏性末端的高效转化载体GhC12B，其特征在于，该载体的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。


2.一种能够对陆地棉基因组5'-TTN-3'碱基位点精确识别并能产生长黏性末端的高效转化载体GhC12B的构建方法，其特征在于，所述的GhC12B载体通过下列步骤制备获得：
(1)获得目的序列AaCas12b-NLS-3xFLAG，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：4所示，该序列通过NCBI上获得(ID:PDB:5WQE)，前后加上BstbⅠ和XbaⅠ两个酶切位点，通过密码子优化合成到pUC57载体上得到新的载体pUC57...

【专利技术属性】
技术研发人员：金双侠，张献龙，王琼琼，王福秋，李波，丁宵，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42