诱导幼苗局部组织膨大建立瞬时表达系统的方法技术方案

本发明专利技术提供一种诱导幼苗局部组织膨大建立瞬时表达系统的方法，涉及生物技术领域。该方法包括以下步骤：重组农杆菌：提取大肠杆菌质粒，将启动子连接到质粒，得到重组表达载体，用重组表达载体转化农杆菌，选取阳性转化农杆菌，扩大培养；活化农杆菌：用菌悬浮培养基培养阳性转化农杆菌，得到农杆菌菌液；处理种子：将种子消毒，接种于固体培养基，培养至幼苗局部组织膨大；介导转化：用农杆菌菌液浸泡局部组织膨大的幼苗，转移至共培养基进行培养，诱导农杆菌侵入幼苗局部膨大组织，形成瞬时表达系统。该方法建立的瞬时表达系统有利于简单快速地检验出种子储藏蛋白启动子的活性，降低纯化目标蛋白质的成本。

【技术实现步骤摘要】
诱导幼苗局部组织膨大建立瞬时表达系统的方法
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种基于种子发芽诱导幼苗局部组织膨大建立瞬时表达系统的方法。
技术介绍
植物可以作为生物反应器生产药用蛋白和其它具有重要价值的蛋白，具有安全、廉价的优点，植物生物反应器能大幅度地提高农业生产的经济效益。瞬时表达是一种快速地研究不同启动子在特定基因表达的一种重要手段，对比传统转基因技术中的转化周期长、效率低及不稳定性，其外源DNA不需要整合到宿主细胞染色体上，因此转化更容易，更快速，转化效率更高。植物细胞几天内可进行多个基因的表达及高效传递，尤其是合成生物学的发展，使瞬时表达有了更大的应用前景。目前，常规的植物瞬时表达体系是利用农杆菌注射烟草叶片进行瞬时表达，以检验启动子的功能或用以表达蛋白质，也有利用植物原生质体进行瞬时表达，或利用植物外植体诱导出愈伤组织来进行瞬时表达。利用农杆菌注射烟草叶片进行瞬时表达来检测启动子的功能最为方便快捷。但是，从烟草叶片中纯化目的蛋白质或药物存在一定的困难，烟草叶片里有大量的无机物和有机物，分离纯化表达蛋白过程繁琐，成本非常高昂。植物愈伤组织和原生质体分离纯化蛋白质的成本虽不高，但过程非常繁琐。
技术实现思路
基于此，有必要针对上述问题，提供一种诱导幼苗局部组织膨大建立瞬时表达系统的方法，在种子发芽的过程中诱导产生局部膨大组织，该膨大组织细胞结构松散，有利于农杆菌转染，而且其中无机物和有机物含量极少，有利于简单快速地检验出种子储藏蛋白启动子的活性，降低纯化目标蛋白质的成本。r>一种诱导幼苗局部组织膨大建立瞬时表达系统的方法，包括以下步骤：重组农杆菌：提取大肠杆菌质粒，将启动子连接到质粒，得到重组表达载体，用重组表达载体转化农杆菌，选取阳性转化农杆菌，扩大培养；活化农杆菌：用菌悬浮培养基培养阳性转化农杆菌，得到农杆菌菌液；处理种子：将种子消毒，接种于固体培养基，培养至幼苗局部组织膨大；介导转化：用农杆菌菌液浸泡局部组织膨大的幼苗，转移至共培养基进行培养，诱导农杆菌侵入幼苗局部膨大组织，形成瞬时表达系统。上述方法，利用固体培养基在短时间内诱导幼苗下胚轴和胚根局部膨大，该膨大组织细胞结构松散，很容易被活化农杆菌侵染得以瞬时转化，形成瞬时表达系统；幼苗的下胚轴和根很娇嫩，其中的无机及有机成分含量极少，有利于后续分离纯化所需的蛋白质，降低提取成本；而且由于幼苗的根部和下胚轴中杂质含量少，染色处理后很容易观察到启动子的功能，能够简单、快速检验出种子储藏蛋白启动子的活性。该方法所得的瞬时表达系统可以作为生物反应器，快速大量生产基因工程药物，克服了用大肠杆菌表达真核生物基因糖基化而影响基因工程药物活性的问题。在其中一个实施例中，所述农杆菌选用EHA105菌株。EHA105菌株毒性较强，侵染效果好。在其中一个实施例中，所述种子为油菜种子。油菜种子中富含油脂蛋白。在其中一个实施例中，所述菌悬浮培养基选用包括0.5±0.1mg/L6-BA、0.1±0.05mg/LNAA、100±1μmol/L乙酰丁香酮和30±1g/L蔗糖的MS培养基。在其中一个实施例中，所述固体培养基选用包括0.5±0.1mg/L6-BA、0.1±0.05mg/LNAA、30±1g/L蔗糖和7-8g/L琼脂的MS培养基。该固体培养基能够使种子在短时间内产生局部组织膨大，有利于农杆菌侵染。在其中一个实施例中，所述共培养基选用包括0.5±0.1mg/L6-BA、0.1±0.05mg/LNAA、100±1μmol/L乙酰丁香酮、30±1g/L蔗糖和8±1g/L琼脂的MS培养基。在其中一个实施例中，所述重组农杆菌步骤具体为：采用碱裂解法提取大肠杆菌PBI101质粒，用HindⅢ与BamHⅠ酶切Oleosin启动子和PBI101质粒，分别回收Oleosin启动子片段和PBI101载体片段，用T4连接酶连接Oleosin启动子片段和PBI101载体片段，构建重组表达载体；采用热激法将重组表达载体转化至农杆菌，用含有50±1mg/L卡那霉素和20-30mg/L利福平的LB培养基筛选转化产物，挑取阳性转化农杆菌，扩大培养。在其中一个实施例中，所述活化农杆菌步骤具体为：将阳性转化农杆菌加入菌悬浮培养基，振荡培养，转速为160-200rpm，培养至农杆菌菌液浓度OD600为0.4-0.6。在其中一个实施例中，所述处理种子步骤具体为：用0.10±0.05wt％HgCl2消毒种子8-10min，用无菌水清洗3-4次，将种子接种于固体培养基，在22-25℃下培养5-10天，种子发芽长出幼苗，且幼苗局部组织膨大。在其中一个实施例中，所述介导转化步骤具体为：用农杆菌菌液浸泡幼苗10-30min，转移至共培养基暗培养3-5天，形成瞬时表达系统。本专利技术一方面还提供一种采用上述方法制备得到的植物瞬时表达系统。该瞬时表达系统可以作为生物反应器，快速大量生产基因工程药物，克服了用大肠杆菌表达真核生物基因糖基化而影响基因工程药物活性的问题。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的方法，利用固体培养基在短时间内诱导幼苗下胚轴和胚根局部膨大，该膨大组织细胞结构松散，很容易被活化农杆菌侵染得以瞬时转化，形成瞬时表达系统；幼苗的下胚轴和根很娇嫩，其中的无机及有机成分含量极少，有利于后续分离纯化所需的蛋白质，降低提取成本；而且由于幼苗的根部和下胚轴中杂质含量少，染色处理后很容易观察到启动子的功能，能够简单、快速检验出种子储藏蛋白启动子的活性。该方法所得的瞬时表达系统可以作为生物反应器，快速大量生产基因工程药物，克服了用大肠杆菌表达真核生物基因糖基化而影响基因工程药物活性的问题。附图说明图1为实施例1中重组表达载体构建示意图；图2为实施例1中Oleosin启动子在油菜幼苗中的GUS染色图；其中，a为空白对照组，b为实施例染色组。具体实施方式为了便于理解本专利技术，以下将给出较佳实施例对本专利技术进行更全面的描述。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。实施例1一、建立瞬时表达系统1试材甘蓝型油菜(Brassicanapus)，来自于中国科学院油料作物研究所。2菌株和载体根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株为EHA105，抗性标记为利福平(Rif)；植物表达载体为pBI101，抗性标记为卡那霉素(kan)。由仲恺农业工程学院生物技术重点实验室保存。3试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶及DNA凝胶回收试剂盒等购自TaK本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导幼苗局部组织膨大建立瞬时表达系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n重组农杆菌：提取大肠杆菌质粒，将启动子连接到质粒，得到重组表达载体，用重组表达载体转化农杆菌，选取阳性转化农杆菌，扩大培养；/n活化农杆菌：用菌悬浮培养基培养阳性转化农杆菌，得到农杆菌菌液；/n处理种子：将种子消毒，接种于固体培养基，培养至幼苗局部组织膨大；/n介导转化：用农杆菌菌液浸泡局部组织膨大的幼苗，转移至共培养基进行培养，诱导农杆菌侵入幼苗局部膨大组织，形成瞬时表达系统。/n

【技术特征摘要】
1.一种诱导幼苗局部组织膨大建立瞬时表达系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：
重组农杆菌：提取大肠杆菌质粒，将启动子连接到质粒，得到重组表达载体，用重组表达载体转化农杆菌，选取阳性转化农杆菌，扩大培养；
活化农杆菌：用菌悬浮培养基培养阳性转化农杆菌，得到农杆菌菌液；
处理种子：将种子消毒，接种于固体培养基，培养至幼苗局部组织膨大；
介导转化：用农杆菌菌液浸泡局部组织膨大的幼苗，转移至共培养基进行培养，诱导农杆菌侵入幼苗局部膨大组织，形成瞬时表达系统。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述农杆菌选用EHA105菌株。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子为油菜种子。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌悬浮培养基选用包括0.5±0.1mg/L6-BA、0.1±0.05mg/LNAA、100±1μmol/L乙酰丁香酮和30±1g/L蔗糖的MS培养基。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体培养基选用包括0.5±0.1mg/L6-BA、0.1±0.05mg/LNAA、30±1g/L蔗糖和7-8g/L琼脂的MS培养基；所述共培养基选用包括0.5±0.1mg/L6-BA、0.1±0.05mg/LNAA、100±1μmol/L乙酰丁香酮、30±1g/L蔗糖和8±1g/L琼脂的MS培养基。
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【专利技术属性】
技术研发人员：王伟权，乐素菊，李树俊，朱欣琪，
申请(专利权)人：仲恺农业工程学院，
类型：发明
国别省市：广东;44