可侵染烟草的大豆花叶病毒侵染性克隆载体和农杆菌菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了可侵染烟草的大豆花叶病毒侵染性克隆载体和农杆菌菌株及其应用。可侵染烟草的大豆花叶病毒侵染性克隆载体序列如SEQ ID NO.1所示。所述的大豆花叶病毒侵染性克隆载体pCB301‑SMV(SC7)在侵染烟草中应用。本发明专利技术中，我们选择能够侵染烟草的大豆花叶病毒株系(SC7)构建侵染性克隆载体，转化农杆菌并注射烟草后，成功的在烟草上形成了系统侵染。这将为烟草在大豆花叶病毒研究方面的应用奠定坚实可靠的基础。

【技术实现步骤摘要】
可侵染烟草的大豆花叶病毒侵染性克隆载体和农杆菌菌株及其应用
本专利技术属于基因工程领域，涉及可侵染烟草的大豆花叶病毒侵染性克隆载体和农杆菌菌株及其应用。
技术介绍
大豆花叶病毒(SMV)属于马铃薯Y病毒属，基因组为一条大小约9.6kb的正义RNA链，包含5’和3’非编码区以及中间的编码序列。其编码序列翻译而成的一条多肽能够通过自我剪切形成10个成熟的病毒蛋白。大豆花叶病毒寄主较窄，但流行范围很广，在全世界的大豆主产区都有不同程度的发生。大豆感染大豆花叶病毒后，会产生花叶、叶片皱缩、顶端枯死等症状，致使植株生长发育受阻、产量和品质下降。研究大豆花叶病毒的致病原因，弄清植物抗大豆花叶病毒的机理，能够使我们更有效的运用分子育种手段实现良好抗病品种的培育。在以前关于大豆花叶病毒和抗大豆花叶病毒基因的研究上，我们一直局限于在大豆植株本身上进行。但是，由于大豆遗传转化困难等原因，相关研究进展并不顺利；并且，由于大豆花叶病毒的侵染范围有限，我们寻找抗病基因的范围始终没有突破物种界限。植物病毒侵染性克隆载体能够为病毒与植物的互作等领域提供新的思路。病毒的RNA基因组本身难以进行体外的基因操作，构建成为以DNA为基础的侵染性克隆之后，我们很容易进行病毒的重组、突变、片段插入缺失等操作，我们还可以使其携带外源基因随病毒的侵染共同表达。烟草是进行植物抗病研究中常用的模式植物。由于少有大豆花叶病毒株系能够侵染烟草，所以在大豆花叶病毒的研究上，鲜有对烟草的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供可侵染烟草的大豆花叶病毒侵染性克隆载体。本专利技术的另一目的是提供转化该载体的农杆菌。本专利技术的又一目的是提供该载体和农杆菌的应用。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：一种可侵染烟草的大豆花叶病毒侵染性克隆载体pCB301-SMV(SC7)，全序列如SEQIDNO.1所示，构建方法如图1所示，载体图谱如图2所示。本专利技术所述的大豆花叶病毒侵染性克隆载体pCB301-SMV(SC7)的构建方法，从感染SMV(SC7)的大豆叶片中提取RNA，反转录成为cDNA，利用多对引物分段扩增获得SMV的片段，然后利用PCR的方法在其3’UTR之后引入PolyA及HDVrz的序列，且各片段之间存在重叠序列；将上述各个片段及利用SmaI和StuI线性化之后的pCB301载体一起转入酵母W303菌株之中进行重组反应；筛选重组成功的载体提取质粒即形成侵染性克隆载体pCB301-SMV(SC7)。作为本专利技术所述的构建方法的一种优选，通过PCR分五段分别扩增获得SMV的片段：模板为反转录所得SMV(SC7)的cDNA，扩增frag1a使用引物1c-F-1和1a-2R，扩增frag2a使用引物2a-F和2a-2R，扩增frag3a使用引物3a-F和3a-R，扩增frag4a使用引物4a-F和4a-R，扩增frag5-1a使用引物5a-F和5a-R-1；其中1c-F-1的序列如SEQIDNO.2所示，1a-2R的序列如SEQIDNO.3所示，2a-F的序列如SEQIDNO.5所示，2a-2R的序列如SEQIDNO.4所示，3a-F的序列如SEQIDNO.6所示，3a-R的序列如SEQIDNO.7所示，4a-F的序列如SEQIDNO.8所示，4a-R的序列如SEQIDNO.9所示，5a-F的序列如SEQIDNO.10所示，5a-R-1的序列如SEQIDNO.11所示。作为本专利技术所述的构建方法的一种优选，通过另外2轮PCR获得含PolyA及HDVrz的片段：首先，以上述PCR所得frag5a-1片段为模板，使用引物5a-F和5a-R-2扩增得到frag5a-2片段；然后以上述PCR所得frag5a-2片段为模板，使用引物5a-F和5a-R-3扩增得到frag5a-3片段即为含PolyA及HDVrz的片段；其中5a-F的序列如SEQIDNO.10所示，5a-R-2的序列如SEQIDNO.12所示，5a-R-3的序列如SEQIDNO.13所示。作为本专利技术所述的构建方法的一种优选，载体pCB301使用NEB内切酶SmaI和StuI进行双酶切得线性化的pCB301载体；将纯化备用的frag1a、frag2a、frag3a、frag4a、frag5a-3以及线性化的pCB301载体按照mol量1:1:1:1:1:1混合均匀，并使用PEG/LiAc介导法转入酵母W303感受态细胞，复苏后涂SD/-Trp平板，放入30℃培养箱倒置培养3天，挑取若干单菌落于液体SD/-Trp培养基中，摇菌过夜后进行酵母质粒的提取，该提取的质粒即为pCB301-SMV(SC7)侵染性克隆载体。转化了本专利技术所述的大豆花叶病毒侵染性克隆载体pCB301-SMV(SC7)的农杆菌。所述的大豆花叶病毒侵染性克隆载体pCB301-SMV(SC7)在侵染烟草中的应用。所述的农杆菌在侵染烟草中的应用。有益效果：1、侵染性克隆载体pCB301-SMV(SC7)携带的大豆花叶病毒序列为DNA形式，便于进行病毒基因组的重组、片段插入等基因操作。2、侵染性克隆载体pCB301-SMV(SC7)及其转化农杆菌形成的菌株ArgSMV(SC7)能够方便稳定并长期保存于低温冰箱，可以有效避免原有大豆花叶病毒通过叶片保存方式的缺点。3、该专利技术打破了大豆花叶病毒抗病研究方面的物种界限，将相关研究拓展到烟草上，能够实现烟草上的大豆花叶病毒致病性分析，从而促进跨物种抗病基因的发掘进程。本专利技术中，我们选择能够侵染烟草的大豆花叶病毒株系(SC7)构建侵染性克隆载体，转化农杆菌并注射烟草后，成功的在烟草上形成了系统侵染。这将为烟草在大豆花叶病毒研究方面的应用奠定坚实可靠的基础。附图说明图1大豆花叶病毒侵染性克隆载体构建流程示意图。图2大豆花叶病毒侵染性克隆载体pCB301-SMV(SC7)载体构成示意图。图3纯化后的大豆花叶病毒片段以及载体琼脂糖凝胶电泳检测图；1：DNAmarker10000；2：SMV扩增片段frag1a；3：SMV扩增片段frag2a；4：SMV扩增片段frag3a；5：SMV扩增片段frag4a；:6：SMV扩增片段frag5a-1；7：SMV扩增片段frag5a-2；8：SMV扩增片段frag5a-3；9：pCB301使用SmaI和StuI线性化之后载体。图4本氏烟注射菌株ArgSMV(SC7)及注射缓冲液1个月后表型对比图；A：本氏烟注射菌株ArgSMV(SC7)后植株表型，叶片边缘向下卷曲，色素分布不均，植株矮化；B：本氏烟注射侵染缓冲液后植株表型，阴性对照，叶片及株型表现正常。图5本氏烟注射菌株ArgSMV(SC7)及注射缓冲液1个月后叶片背面细节对比图；所取叶片为注射上位叶A：本氏烟注射菌株ArgSMV(SC7)后叶片背面表型；B：本氏烟注射侵染缓冲液后叶片背面表型。图6用PCR的方法检测烟草叶片中的SMV病毒积累；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可侵染烟草的大豆花叶病毒侵染性克隆载体pCB301-SMV(SC7)，其特征在于序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种可侵染烟草的大豆花叶病毒侵染性克隆载体pCB301-SMV(SC7)，其特征在于序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述的大豆花叶病毒侵染性克隆载体pCB301-SMV(SC7)的构建方法，其特征在于从感染大豆花叶病毒SC7的大豆叶片中提取RNA，反转录成为cDNA，利用多对引物分段扩增获得大豆花叶病毒SC7的片段，然后利用PCR的方法在最后一个片段的3’UTR之后引入PolyA及HDVrz的序列，且各片段之间存在重叠序列；将上述各个片段及利用SmaI和StuI线性化之后的pCB301载体一起转入酵母W303菌株之中进行重组反应；筛选重组成功的载体提取质粒即形成侵染性克隆载体pCB301-SMV(SC7)。


3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于通过第一轮PCR分五段分别扩增获得SMV的片段：模板为反转录所得SMV(SC7)的cDNA，扩增frag1a使用引物1c-F-1和1a-2R，扩增frag2a使用引物2a-F和2a-2R，扩增frag3a使用引物3a-F和3a-R，扩增frag4a使用引物4a-F和4a-R，扩增frag5-1a使用引物5a-F和5a-R-1；其中1c-F-1的序列如SEQIDNO.2所示，1a-2R的序列如SEQIDNO.3所示，2a-F的序列如SEQIDNO.5所示，2a-2R的序列如SEQIDNO.4所示，3a-F的序列如SEQIDNO.6所示，3a-R的序列如SEQIDNO.7所示，4a-F的序列如SEQIDNO.8所示，4a-R的序列如SEQIDNO.9所示，5a-F的序列如SEQIDNO.10所示，5a-...

【专利技术属性】
技术研发人员：智海剑，殷金龙，王丽群，刘慧，晋彤彤，李凯，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32