多基因敲除突变体在旱稻育种中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种多基因敲除突变体在早稻育种中的应用，所述多基因敲除突变体的基因GW2第4外显子位于基因组第2087位碱基A缺失，碱基序列如SEQ ID NO.1；同时多基因敲除突变体的基因SD1第1外显子位于基因组第359‑360位间插入碱基A，第377‑760位384bp替换为A，碱基序列如SEQ ID NO.2。本发明专利技术通过CRISPR/Cas9多基因技术成功获得了多基因突变体，所述多基因突变体与野生型早稻相比，穗数和千粒重增加，株高降低，显著提高了早稻的产量，而且抗倒伏，在早稻育种中有很大的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
多基因敲除突变体在旱稻育种中的应用
本专利技术涉及转基因早稻领域，尤其涉及多基因敲除突变体在早稻育种中的应用。
技术介绍
水稻是我国第一大粮食作物，约占粮食总产量的40％。然而水稻需水量大，约占农业用水的70％。我国地域广阔，水资源分布不均，西北地区长期缺水、华北地区旱灾频繁、云南西南部高寒贫困山区及半山区地形地势复杂，雨量分布在季节上不平衡，旱灾在长江流域和华南稻区也频繁发生，一旦干旱发生，水稻往往大幅减产。随着工业和城市用水及其它农业用水的迅猛增长也使水稻灌溉越来越难以保证，干旱缺水与水稻用水的供需矛盾日益严重，发展节水农业已经迫在眉睫。早稻(陆稻)品种较水稻品种具有较强的节水抗旱性能，其种植管理方式与小麦相似，耗水量仅是水稻的1/5～1/3。此外早稻还具有耐瘠、适应性广等特点。但是相比于水稻，早稻产量普遍较低且品质较差。因此培育优质高产早稻新品种，发展早稻旱作生产可以改变传统稻作生产栽培耕作方式、节约淡水资源，是实现稻谷可持续生产的新革命。云南省农业科学院粮作所选育的早稻新品种陆引46，2017年8月18日通过越南农业与农村发展部审定。陆引46系籼型早稻，是云南省早稻主栽品种。该品种表现为株型紧凑、分蘖力旺盛，同杂草竞争力强，兼顾了多穗型和大穗型的特点，抗稻瘟病，生育期适中，米质中上，但是产量优势不明显，故本专利技术旨在通过基因编辑手段提高早稻的产量。
技术实现思路
本专利技术提供一种多基因敲除突变体在早稻育种中的应用，利用CRISPR/cas9多基因敲除的方法同时对早稻中限制产量的多个关键基因进行基因敲除，获得提高早稻产量的多基因敲除突变体。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案如下：一种多基因敲除突变体在早稻育种中的应用，所述多基因敲除突变体的基因GW2第4外显子位于基因组第2087位碱基A缺失，碱基序列如SEQIDNO.1；同时多基因敲除突变体的基因SD1第1外显子位于基因组第359-360位间插入碱基A，第377-760位384bp替换为A，碱基序列如SEQIDNO.2。作为优选，所述早稻为籼系早稻，尤其适用于早稻陆引46。进一步地，用于检测多基因敲除突变体的引物如下：GW2-F：AAAAGGGATATGCACCG；GW2-R：CCAGGCTACAATGACACC；SD1-F：TCTCATCTCCAATCTCATGGTGGCC；SD1-R：CAGGTCGGTTTCTTCCCGCTTTC。进一步地，多基因敲除突变体通过以下方法获得：利用CRISPR/cas9基因敲除系统构建多靶点表达载体，采用农杆菌介导的方法将多靶点表达载体转化早稻愈伤组织，对以下靶点基因组合进行定点敲除，获得基因GW2和SD1同时编辑的多基因敲除突变体；所述靶点基因组合如下：基因GW2和基因SD1；或基因GW2、基因SD1和基因DEP1；或基因GW2、基因SD1和基因GS3；或基因GW2、基因SD1、基因DEP1和基因GS3。本专利技术对DEP1，GS3，GW2和SD1中的2～4个基因进行同时敲除，获得数个基因敲除的突变体，通过培育发现本专利技术提供的双基因突变体能显著提高产量，而且能够抗倒伏。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术克服了早稻难以进行基因编辑的难点，通过CRISPR/Cas9多基因技术成功获得了多基因突变体，所述多基因突变体与野生型早稻相比，穗数和千粒重增加，株高降低，显著提高了早稻的产量，而且抗倒伏，在早稻育种中有很大的应用价值。附图说明图1为lacz-OSU6a-GW2-sgRNA表达盒；图2为OSU6b-SD1-sgRNA表达盒；图3为OSU6c-GS3-sgRNA表达盒；图4为OSU3-DEP1-sgRNA表达盒；图5为LY46-HY-1载体图谱；图6为LY46-HY-3载体图谱；图7为LY46-HY-4载体图谱；图8为陆引46突变体拷种结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细说明，但本专利技术并不局限于以下技术方案。以下实施例采用pYLCRISPR/Cas9菌种(TOP10F′)、CRISPR/sgRNAvectors菌种(DH10B)、启动子OsU6a、OsU6b、OsU6c和OsU3a均来自于华南农业大学生命科学学院刘耀光课题组。实施例11载体构建1.1受体材料LY46中靶基因检测在转化受体籼系早稻陆引46(LY46)中进行PCR和测序，检测靶基因DEP1，GS3，GW2，SD1、Gn1a的突变情况。实验结果表明，LY46中，共有4个基因DEP1，GS3，GW2，SD1需要进行多基因敲除(陆引46中无法检测到Gn1a基因，认为该基因在陆引46中已经发生大片段de1etion)，这四个基因的碱基序列均可在基因数据库中查到。1.2靶点设计根据LY46中靶基因检测结果，设计和确定靶点设计结果如表1所示：基因DEP1在exon5处设计靶点，位于基因组第3353-3372位碱基。基因GS3在exon1处设计靶点，位于基因组第117-136位碱基。基因GW2在exon4处设计靶点，位于基因组第2071-2090位碱基。基因SD1在exon1处设计靶点，位于基因组第356-375位碱基。表11.3载体构建本实施例使用水稻来源的4个smallnuclearRNA启动子的表达水平为OsU6a＞OsU6b＞OsU6c＞OsU3a。当连接靶点多于4个时，为了降低相同启动子序列在农杆菌发生同源重组的可能性，使相同启动子间的距离尽量近。因此U3、U6a～c启动子的使用和排列方式为：1个靶点：LacZ-U6a2个靶点：LacZ-U6a-U6b3个靶点：LacZ-U6a-U6b-U6c4个靶点：LacZ-U6a-U6b-U6c-U3对于LY46，U3、U6a～c启动子和sgRNA表达盒的使用和排列方式为4个基因靶点排列方式如下：LacZ-U6a-GW2---U6b-SD1---U6c-GS3---U3-DEP13个基因靶点的2组排列如下：LacZ-U6a-GW2---U6b-SD1-----------------U3-DEP1LacZ-U6a-GW2---U6b-SD1---U6c-GS3------------------1.3.1载体构建操作方法本实施例构建了多基因靶点载体，分别为：LY-HY-14个靶点：U6a-GW2---U6b-SD1---U6c-GS3---U3-DEP1；LY-HY-33个靶点：U6a-GW2---U6b-SD1---U3-DEP1；LY-HY-43个靶点：U6a-GW2---U6b-SD1---U6c-GS3；由于3个多基因靶点载体的构建过程基本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多基因敲除突变体在早稻育种中的应用，其特征在于，所述多基因敲除突变体的基因GW2第4外显子位于基因组第2087位碱基A缺失，碱基序列如SEQ ID NO.1；同时多基因敲除突变体的基因SD1第1外显子位于基因组第359-360位间插入碱基A，第377-760位384bp替换为A，碱基序列如SEQ ID NO.2。/n

【技术特征摘要】
1.一种多基因敲除突变体在早稻育种中的应用，其特征在于，所述多基因敲除突变体的基因GW2第4外显子位于基因组第2087位碱基A缺失，碱基序列如SEQIDNO.1；同时多基因敲除突变体的基因SD1第1外显子位于基因组第359-360位间插入碱基A，第377-760位384bp替换为A，碱基序列如SEQIDNO.2。


2.根据权利要求1所述的多基因敲除突变体在早稻育种中的应用，其特征在于，用于检测多基因敲除突变体的引物如下：
GW2-F：AAAAGGGATATGCACCG；
GW2-R：CCAGGCTACAATGACACC；
SD1-F：TCTCATCTCCAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张业胜，李艳霞，黄立钰，王文，胡凤益，
申请(专利权)人：保山华大智慧农业科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53