本发明专利技术涉及一个共表达载体，这个载体上包含有截短型血管性血友病因子(vWF)‑Fc DNA结构和B区缺失型FVIII DNA结构。本发明专利技术通过在细胞中使用一个表达载体共表达FVIII和截短型vWF‑Fc，来控制FVIII和vWF蛋白的基因模板的比例，从而使细胞表达过程中FVIII和vWF的比例更高，这就提高了vWF中FVIII的占有率，创造了FVIII蛋白分子的高表达量(＞1000IU/ml)和更稳定的蛋白表达。在一个优选的实施例中，截短型vWF在其D’D3区包含半胱氨酸突变，从而降低了表达过程中重组vWF多聚体的组装，使得FVIII的回收率和质量都得到了提高。
【技术实现步骤摘要】
血管性血友病因子片段和八因子的共表达载体专利
本专利技术涉及一个共表达载体，此载体同时表达血管性血友病因子片段(vonWillebrandFactor，vWF)DNA结构和B-区缺失型FVIIIDNA结构。参考序列列表、表格或者计算机程序序列列表以ASCII文本文档的格式通过EFS-Web和专利说明书同时提交，文件名称为SequenceListing.txt，创建时间为2019年5月28日，文件大小为129kb。通过EFS-Web提交的序列列表是专利说明书的一部分，在此通过引用的方式合并成一个整体。背景凝血过程被称之为凝血级联，是通过一个复杂且动态的生物途径进行的，是一系列相互依赖的生化反应。凝血过程包括三种途径：外源性凝血途径、内源性凝血途径和共同途径。八因子(FVIII)是一种糖蛋白，通常在血液中和全长vWF形成复合物，以一种没有活性的辅助因子形式存在，二者的比例是1：50。FVIII在内源性凝血途径中起关键性作用，维持了正常的止血过程。全长FVIII是由重链(A1-A2-B区)和轻链(A3-C1-C2区)非共价键结合的异质二聚体。当遇到伤害时，被激活的FVIII与vWF分离，在激活血小板的带电磷脂膜表面与活性凝血因子IXa和因子X结合成复合物(称为X酶复合物)。X酶复合物进一步激活因子X，因子Xa然后激活凝血酶原变成凝血酶，凝血酶进一步激活其他凝血级联反应中的成分形成稳定的凝血块。A型血友病是一种先天性X染色体连锁的FVIII活性缺失的出血性疾病。FVIII活性的减弱抑制了凝血级联反应中的正反馈循环，最终导致长时间的出血性事件、广泛的淤青、自发性口鼻出血、关节僵硬和慢性疼痛，某些情况下也有可能导致内出血和贫血。最常见的治疗A型血友病的方法是凝血因子替代疗法，即静脉注射人血浆来源的FVIII或者重组FVIII。使用哺乳动物细胞大量表达重组FVIII(RecombinantFVIII，rFVIII)很困难且具有挑战性，主要是因为这个蛋白的分子量很大(～300KDa)、翻译后修饰的复杂性(例如：大量的糖基化和酪氨酸硫酸化位点)以及表达元件的限制(如mRNA不稳定)。中心B区域的移除大大提高了rFVIII的产量，但是市场上rFVIII的商业化生产水平也通常只有20-50IU/ml。其他导致哺乳动物细胞中rFVIII产量较低的因素可能有：特异性或非特异性的结合在表达细胞膜上，以及FVIII的不稳定性(Kaufman，1989，Mol.Cell.Biol.，vol.3，pp.1233-1242：USPatentNo.8,759,293)。美国专利No.8,759,293公开了一种FVIII的制备方法。‘293专利中的图6展示了两个不同的质粒表达载体，第一个载体能够利用独立启动子表达具有VWF前肽序列的成熟vWF或者截短型vWF-Fc融合多肽。第二个具有独立启动子载体则能够表达人源FVIII因子。这两个质粒共转染进入哺乳动物细胞，通过筛选挑选出能够表达(i)vWF或者vWF-Fc，(ii)vWF前肽，以及(iii)FVIII的稳定细胞株。这个方法的问题在于表达FVIII和vWF-FC的质粒是分别独立进入哺乳动物细胞的，所以导致筛选出的细胞中两种质粒的比例都是各不相同的。由于不确定转入质粒的比例，因此比较难筛选出能够稳定表达蛋白的可重复生产的细胞株，蛋白的产量也会随着时间发生变化。例如，通过连续转染获得的细胞株最初可能含有10拷贝的FVIII和30拷贝的vWF-Fc，vWF-Fc的产量就会高于FVIII，这就会增加下游纯化FVIII的难度。更进一步来说，如果细胞中这两种质粒的比例随着时间发生了变化，即FVIII质粒数量减少而vWF质粒数量不变，那么这个细胞株我们就不再需要了。相对于一种质粒来说另一种质粒的缺失可能会打破表达水平的平衡，也会增加纯化的难度。目前有必要提高供病人使用的重组FVIII的质量和产量，有必要改善FVIII的表达并提高纯化后FVIII的产量。附图说明图1A-1C展示了一种双重表达载体的结构，在这个载体中并列克隆了人的FVIII因子、截短的或者突变的vWF-FccDNA。(1A)整体上展示了双重表达载体，载体上包含FVIII、vWF-Fc变异基因序列，由巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子控制。(1B)介绍了FVIII和截短型vWF(携带或不携带vWF前肽区)的共同表达方法。同时展示了VWF片段与免疫球蛋白Fc区的融合选项(Pro-D’D3-Fc包含，而Del-D’D3-Fc不包含前肽区)。(1C)介绍了FVIII和截短/突变的vWF(根据HGVS的编号规范，在完整野生型FVIII序列的C1099和C1142号氨基酸，携带或者不携带vWF前肽区)的共同表达。图2A-2D展示了由VWFD’D3区和人的IgG1的Fc铰链区融合产生的截短型人vWF-Fc蛋白的示意图。(2A)分泌的vWF多肽的域结构(不包括信号肽序列)。D1和D2代表vWF前肽序列，D’D3包含FVIII结合位点，CK是野生型vWF的终端二聚化结构域。(2B1)Pro-D’D3-Fc是一个截短型vWF蛋白，包含前肽(D1D2区域)和融合到Fc区的D’D3区域。(2B2)D1D2区从vWF上被物理性的移除，将信号肽直接融合到D’D3-Fc序列N-端，形成了Del-D’D3-Fc。(2C)一种成熟的截短型产物，不含有D1D2，名字叫做D’D3-Fc。(2D)野生型D’D3区域通过二硫键形成多聚体，而D’D3的二聚化是通过C端Fc融合区域之间的相互作用形成的。图3A-3D展示了截短型人vWF-Fc蛋白的示意图，在C1099和C1142氨基酸位点上发生了突变。(3A)分泌的突变vWF多肽的域结构(不包括信号肽序列)。D1D2是前肽区，D’D3包含FVIII结合位点，而且也包含了C1099和C1142氨基酸位点的突变(D3区域的竖线)。(3B1)Pro-D’D3mut-Fc正如前面描述的Pro-D’D3-Fc，只是在C1099和C1142氨基酸位点上发生了突变。(3B2)在这种形式中，D1D2区从vWF上被物理性的移除，信号肽直接链接于含有C1099和C1142突变位点的D’D3-Fc序列N-端，形成了Del-D’D3mut-Fc。(3C)一种成熟的截短型产物，不含有D1D2，名字叫做D’D3mut-Fc。(3D)C1099和C1142氨基酸位点的突变(星号)阻断了野生型D’D3区域多聚体的形成，而D’D3的二聚化可以通过C端Fc融合区域之间的相互作用形成。图4A-4B展示了D’D3-Fc或D’D3mut-Fc蛋白和FVIII的组装。(4A)如图3所示，D’D3-Fc(没有引入突变)导致了多聚体组装和二聚化。例如，在多聚化D’D3-Fc分子中有两个位点用于结合FVIII。(4B)由于C1099和C1142氨基酸位点引入了突变(星号表示)，D’D3mut-Fc融合蛋白预计会组装成二聚体而不是多聚体。图5A-5B说明了在FVIII/截短型vWF-Fc复合物捕获和回收方面的可能存本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.载体包含：/n(a)第一个多核苷酸序列，编码B区缺失型八因子蛋白(FVIII)，可操作地连接第一个启动子。/n(b)第二个多核苷酸序列，编码C端融合有免疫球蛋白Fc的截短型血管性血友病因子(vWF)的融合蛋白，可操作地连接第二个启动子。/n其中截短型vWF包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4这四种氨基酸序列，或者具有95％序列一致性的氨基酸序列。/n
【技术特征摘要】
20190402 US 16/373,5111.载体包含：
(a)第一个多核苷酸序列，编码B区缺失型八因子蛋白(FVIII)，可操作地连接第一个启动子。
(b)第二个多核苷酸序列，编码C端融合有免疫球蛋白Fc的截短型血管性血友病因子(vWF)的融合蛋白，可操作地连接第二个启动子。
其中截短型vWF包含SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3或SEQIDNO：4这四种氨基酸序列，或者具有95％序列一致性的氨基酸序列。
2.权利要求1中所描述的载体，其中的截短型vWF包含氨基酸序列SEQIDNO：1，或是具有95％序列一致性的氨基酸序列，但是第336和第379号位点的氨基酸残基不是半胱氨酸。
3.权利要求2中所描述的载体，其中的截短型vWF包含氨基酸序列SEQIDNO：1。
4.权利要求1中所描述的载体，其中的截短型vWF包含氨基酸序列SEQIDNO：2，或是具有95％序列一致...
【专利技术属性】
技术研发人员：李齐，张海龙，
申请(专利权)人：庄亚北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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