单域抗体融合蛋白及其在止血中的应用制造技术

本发明专利技术涉及的是抗TREM(髓系细胞触发受体)的单域抗体(sdAb)，以TREM类转录因子

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单域抗体融合蛋白及其在止血中的应用
[0001]本专利技术

[0002]本专利技术主要涉及的是抗TREM(triggering receptors expressed on myeloid cells骨髓细胞的触发受体)类转录因子
‑
1(TLT
‑
1)分子的单域抗体(sdAb)。TLT
‑
1分子存在于损伤部位的活化血小板上，尤其存在于血栓外围活化的血小板上。除此之外，本专利技术还涉及到单域抗体和组织因子的胞外(可溶性)结构域(sTF)融合蛋白。这种融合蛋白可将sTF引导至损伤部位的活化血小板表面从而促进止血。患有出血性疾病的个体，例如血友病A，血友病B，或由于外伤引起的急性出血，可以从使用这种融合蛋白的治疗中受益。
[0003]专利技术背景
[0004]血小板通常以静息(非激活)的状态在血流中循环。当血管受损时，血小板通过血小板糖蛋白(GP)，例如GP Ib
‑
IX
‑
V和GP IIb/IIIa受体以及在那里表达的组织因子，与受损的内皮下细胞相互作用。这种相互作用在损伤部位引发血小板粘附，聚集和活化以及血小板形状变化，以及随后的α
‑
和致密颗粒释放。除了其他膜蛋白外，活化的血小板同时表达P
‑
selectin和TLT
‑
1受体，P
‑
selectin介导与白细胞的相互作用，而TLT
‑
1受体增强钙离子的流入并促进激活血小板在表面聚集。研究表明TLT
‑
1受体仅在活化的血小板表面表达，这使其成为凝血因子定位的理想靶分子。活化的血小板基本上只在损伤部位被发现，也有研究认为血小板活化可能和某些疾病有关。活化的血小板(Dale，2005，J.Thromb.Haemost.Volume 3，pp.2185
‑
2192)可定义为在血小板表面表达P
‑
selectin，GPIIb/IIIa和CD40L蛋白等(Yun等，2016，Biomed Res.Inter.，第2016卷，e9060143)。活化的血小板还诱导膜磷脂酰丝氨酸(PS)翻转和导致其暴露于其表面，这些PS的功能是介导血小板与凝血蛋白的相互作用。含有PS的血小板衍生膜表面带负电荷，其在激活凝血酶原酶复合物的形成方面起着关键作用。这是驱动凝血酶产生的凝血途径的最后一步，随后形成纤维蛋白。
[0005]止血是一种自然凝血机制，发生在受伤部位以防止过度出血。治疗出血性疾病的理想治疗分子应该只作用于损伤部位，因此将凝血因子定位在损伤部位是止血治疗的关键所在。(Novo Nordisk，Denmark)是一种在培养的哺乳动物细胞中产生的重组FVIIa(recFVIIa)分子。它一直是治疗已出现凝血因子FVIII和FIX抑制剂血友病患者的主要生物分子。因此，像重组FVIIa这样的分子常被称为“旁路剂”。在正常止血条件下，血液中循环的FVII因子可与血管外膜损伤部位暴露的组织因子(TF)结合，并被TF激活，以TF/FVIIa复合物的方式将FX裂解为FXa。重组FVIIa，作为一种独立的分子，给药后基本上“绕过了”FVII和TF的正常相互作用，并独立于组织因子(主要存在并仅在损伤部位暴露)作用于FX。为了达到这种效果，FVIIa需要以药理学上的大量给药来模拟天然FVII
‑
TF激活(即FX激活)的效果。重组FVIIa与细胞膜的结合，不包括和TF的相互作用，似乎是由暴露于活化血小板脂质层中的磷脂酰丝氨酸介导的，并且与血浆来源的FVII非常相似，通过FVIIa活性位点蛋白水解介导FX的激活。血友病A和B患者治疗中需要大剂量的重组FVIIa的原因至少部分被认为是由于FVIIa与血小板的PS结合率低和缺乏与TF的协同性。其他“旁路剂”，如FEIBA(Baxter International)，由血浆来源的凝血因子的混合物组成，其中仅包括一小部分活
化的凝血因子，又如FVIIa，可用于治疗产生抑制物的血友病A和B患者；然而，由于其不同内容的性质和可变性，产品的精确分析很难做到。
[0006]与严格依赖凝血因子本身的特性不同，磷脂酰丝氨酸结合蛋白，如Annexin V和乳粘蛋白C
‑
2蛋白，已被认为是潜在的靶向载体，可将凝血因子和其他分子引导至位于受伤部位的被活化了的血小板的脂质双层，以加速止血的进程。例如，Annexin V对细胞膜中的PS具有高亲和力和高特异性(Thiagarajan和Tait，1991，J.Biol.Chem.，第266卷，第24302
‑
24307页；Rescher和Gerke，2004，J.Cell Sci.，第117卷，第2631
‑
2639页)，从而使其成为靶向活化血小板的理想选择。比如，将这些靶向蛋白区域与凝血因子结合的融合蛋白代表了一种与活化血小板相互作用的替代方法，可能比单独使用重组FVIIa具有更高的亲和力。组织因子胞外域与Annexin V组成的融合蛋白在出血模型中具有很强的止血作用(Huang等人，2006年，Blood，第107卷，第980
‑
986页)，它代表了一种潜在的“旁路”剂。不幸的是，尽管它们具有潜在的用途，但是这种能与PS特异性结合的Annexin V类似的分子有以下几个缺点：除了活化的血小板，磷脂酰丝氨酸可以在非血小板细胞的表面(如凋亡或垂死细胞)以及其他细胞类型上表达，另外PS结合蛋白或其融合蛋白可以与其他凝血因子竞争与活化血小板表面上的PS的结合，从而对凝血过程起到了阻碍(Thiagarajan和Tait，1991，J.Biol.Chem.，第266卷，第24302
‑
24307页)。
[0007]实现对特定类型细胞的高亲和力和高特异性的另一种方法是通过抗体。单克隆抗体被广泛用于将治疗分子靶向各种细胞和血小板，包括将特定药物递送至癌症靶标(例如Yang等，2018，Biotechnol.Lett.，第40卷，第789
‑
795页；Khongorzul等，2020，Mol.Cancer Res.，第18卷，第3
‑
19页)或损伤组织(Runge等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)，第84卷，第7659
‑
7662页)。一般来说，它们的分子量过大(150kDa)，与其形成的融合蛋白的分子量甚至更大。并且由于其复杂的重链和轻链结构以及翻译后修饰所导致的灵活性上的限制，会导致和某些目标相关表位的结合能力降低，生产和纯化成本也会相对较高，从而限制了它们在开发治疗性融合蛋白衍生物中的应用。此外，它们较长的血浆半衰期对止血可能是不利的，在这种情况下，可能需要短暂的和自我调节的属性。事实上，很少有涉及单克隆抗体的分子融合蛋白被成功地生产或使用。
[0008]相比之下，单域抗体(sdAb)，也称为纳米抗体或VHH结构域，是源自骆驼科成员血清中存在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种针对TLT
‑
1的单域抗体，包括：(a)CDR1，为SEQ ID NO：6，CDR2，为SEQ ID NO：32，CDR3，为SEQ ID NO：43；(b)CDR1，为SEQ ID NO：8，CDR2，为SEQ ID NO：31，CDR3，为SEQ ID NO：44；(c)CDR1，为SEQ ID NO：3，CDR2，为SEQ ID NO：31，CDR3，为SEQ ID NO：41；(d)CDR1，为SEQ ID NO：3，CDR2，为SEQ ID NO：31，CDR3，为SEQ ID NO：42；(e)CDR1，为SEQ ID NO：1，CDR2，为SEQ ID NO：31，CDR3，为SEQ ID NO：40；(f)CDR1，为SEQ ID NO：25，CDR2，为SEQ ID NO：35，CDR3，为SEQ ID NO：45；(g)CDR1，为SEQ ID NO：3，CDR2，为SEQ ID NO：31，CDR3，为SEQ ID NO：46；(h)CDR1，为SEQ ID NO：11，CDR2，为SEQ ID NO：31，CDR3，为SEQ ID NO：47；(i)CDR1，为SEQ ID NO：16，CDR2，为SEQ ID NO：31，CDR3，为SEQ ID NO：50；或(j)CDR1，为SEQ ID NO：25，CDR2，为SEQ ID NO：35，CDR3，为SEQ ID NO：59。2.根据权利要求1所述的单域抗体，包含选自SEQ ID NO：68，70，64，65，62，71，74，76，80，和95的序列，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李齐，邹骅飞，
申请(专利权)人：庄亚北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：