包含抗间皮素抗体、抗CD3抗体或抗EGFR抗体的融合蛋白、包含所述融合蛋白的双特异性或三特异性抗体，及其用途制造技术

本发明专利技术涉及：包含抗间皮素抗体、抗CD3抗体或抗EGFR抗体的片段的融合蛋白；对间皮素和CD3具有特异性的双特异性抗体；对间皮素、CD3和EGFR具有特异性的三特异性抗体；及其用途。根据本发明专利技术的双特异性或三特异性抗体可以以高产率和以高纯度进行制备，以及具有优异的肿瘤杀伤和生长抑制作用，并因此可有效地用于癌症治疗。症治疗。症治疗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含抗间皮素抗体、抗CD3抗体或抗EGFR抗体的融合蛋白、包含所述融合蛋白的双特异性或三特异性抗体，及其用途


[0001]本专利技术涉及包含抗间皮素抗体、抗CD3抗体或抗EGFR抗体的融合蛋白；以及对间皮素和CD3具有特异性的双特异性抗体，以及对间皮素、CD3和EGFR具有特异性的三特异性抗体；及其用途。

技术介绍

[0002]在抗癌治疗中，单克隆抗体作为第一癌症免疫治疗，不仅在实体癌中而且在血癌中均显示出优异的作用；然而，其仍具有限制性。在这方面，引入了这样的技术：其中对抗体的Fc区进行改造以提高抗体的抗体依赖性细胞毒性(antibody
‑
dependent cytotoxicity，ADCC)作用，或者其中对双特异性或三特异性抗体进行开发以使得单一抗体可接近多种靶标。
[0003]双特异性抗体是可同时与两种不同抗体结合的抗体，并且可被改造以使得免疫细胞(例如T细胞)仅对特定靶细胞(例如癌细胞)具有毒性并且对其他正常细胞无毒性。这样的双特异性抗体可表现出最大的癌症治疗作用和最小的副作用。因此，开发了数种双特异性抗体形式，并且报道了其适用于T细胞介导的免疫治疗。
[0004]然而，存在的问题是在产生双特异性抗体的过程期间共表达时，不同特异性的抗体重链和轻链的错配导致许多非功能性副产物。因此，为了解决该问题，需要开发用于以临床上足够的量和纯度产生期望的多特异性抗体构建体的技术。

技术实现思路

[0005]技术问题
[0006]作为进行深入研究以解决现有双特异性抗体的问题的结果，本专利技术人开发了融合蛋白，其中抗体的重链和轻链通过接头连接并因此作为单链包含在内，以及包含所述融合蛋白的双特异性或三特异性抗体；并且发现这些融合蛋白和抗体解决了错配的问题，并对肿瘤细胞具有高杀伤作用，从而完成了本专利技术。
[0007]因此，本专利技术的一个目的是提供包含抗间皮素抗体、抗CD3抗体或抗EGFR抗体的融合蛋白，以及包含所述融合蛋白的双特异性或三特异性抗体，以及用于使用前述来治疗癌症的方法。
[0008]技术方案
[0009]为了解决上述问题，在本专利技术的一个方面中，提供了单链形式的第一融合蛋白，其包含与间皮素特异性结合的抗体和与CD3特异性结合的抗体。
[0010]在本专利技术的另一个方面中，提供了单链形式的第二融合蛋白，其包含与间皮素特异性结合的抗体。
[0011]在本专利技术的又一个方面中，提供了单链形式的第三融合蛋白，其包含与EGFR特异性结合的抗体。
[0012]在本专利技术的又一个方面中，提供了双特异性抗体，其包含第一融合蛋白和第二融合蛋白。
[0013]在本专利技术的又一个方面中，提供了三特异性抗体，其包含第一融合蛋白和第三融合蛋白。
[0014]在本专利技术的又一个方面中，提供了用于治疗癌症的药物组合物，其包含所述融合蛋白、双特异性抗体或三特异性抗体作为活性成分。
[0015]在本专利技术的又一个方面中，提供了所述融合蛋白、双特异性抗体或三特异性抗体的用途。
[0016]在本专利技术的又一个方面中，提供了用于治疗癌症的方法，其包括向个体施用治疗有效量的用于治疗癌症的药物组合物的步骤。
[0017]有益效果
[0018]本专利技术的融合蛋白和包含所述融合蛋白的双特异性抗体或三特异性抗体可以以高产率和纯度来产生，并且由于其优异的肿瘤杀伤和生长抑制作用可有效地用于癌症治疗。
附图说明
[0019]图1示出了抗MSLN/抗CD3双特异性抗体(在下文中称为HMI323/HMI323
‑
A15)的示例性示意图。
[0020]图2示出了抗EGFR/抗MSLN/抗CD3三特异性抗体(在下文中称为西妥昔单抗(Cetuximab)/HMI323
‑
A15)的示例性示意图。
[0021]图3示出了通过对HMI323/HMI323
‑
A15进行尺寸排阻色谱而获得的结果。
[0022]图4示出了通过对HMI323/HMI323
‑
A15进行SDS
‑
PAGE而获得的结果。
[0023]图5示出了通过对西妥昔单抗/HMI323
‑
A15进行尺寸排阻色谱而获得的结果。
[0024]图6示出了通过对西妥昔单抗/HMI323
‑
A15进行SDS
‑
PAGE而获得的结果。
[0025]图7示出了通过用荧光激活细胞分选仪(fluorescence activated cell sorter，FACS)测量HMI323/HMI323
‑
A15或西妥昔单抗/HMI323
‑
A15与H226癌细胞系的结合能力而获得的结果。
[0026]图8示出了通过用FACS测量HMI323/HMI323
‑
A15或西妥昔单抗/HMI323
‑
A15与AsPC
‑
1癌细胞系的结合能力而获得的结果。
[0027]图9示出了通过用FACS测量HMI323/HMI323
‑
A15或西妥昔单抗/HMI323
‑
A15与Jurkat细胞系的结合能力而获得的结果。
[0028]图10示出了通过将PBMC和H226癌细胞系的混合物(以PBMC∶靶细胞＝10∶1的比率)用HMI323/HMI323
‑
A15或西妥昔单抗/HMI323
‑
A15进行处理，并随后在24小时之后观察细胞死亡而获得的结果。
[0029]图11示出了通过将PBMC和AsPC
‑
1癌细胞系的混合物(以PBMC∶靶细胞＝10∶1的比率)用HMI323/HMI323
‑
A15或西妥昔单抗/HMI323
‑
A15进行处理，并随后在24小时之后观察细胞死亡而获得的结果。
[0030]图12示出了通过将PBMC和H226癌细胞系的混合物(以PBMC∶靶细胞＝10∶1的比率)用HMI323/HMI323
‑
A15或西妥昔单抗/HMI323
‑
A15进行处理，并随后在48小时之后观察细胞
死亡而获得的结果。
[0031]图13示出了通过将PBMC和AsPC
‑
1癌细胞系的混合物(以PBMC∶靶细胞＝10∶1的比率)用HMI323/HMI323
‑
A15或西妥昔单抗/HMI323
‑
A15进行处理，并随后在48小时之后观察细胞死亡而获得的结果。
[0032]图14示出了通过将PBMC和H226癌细胞系的混合物(以PBMC∶靶细胞＝20∶1的比率)用HMI323/HMI323
‑
A15或西妥昔单抗/HMI323
‑
A15进行处理，并随后在48小时之后观察细胞死亡而本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.第一融合蛋白，其具有以下结构式1：[结构式1]N
′‑
A
‑
B
‑
L1
‑
C
‑
D
‑
L2
‑
E
‑
F
‑
L3
‑
G
‑
H
‑
L4
‑
I
‑
C
′
其中N
’
是所述融合蛋白的N端，C
’
是所述融合蛋白的C端，A是与间皮素特异性结合的抗体的轻链可变结构域，所述结构域包含SEQ ID NO：25的轻链CDR1、SEQ ID NO：26的轻链CDR2和SEQ ID NO：27的轻链CDR3，B是所述抗体的轻链恒定结构域，C是与间皮素特异性结合的抗体的重链可变结构域，所述结构域包含SEQ ID NO：28的重链CDR1、SEQ ID NO：29的重链CDR2和SEQ ID NO：30的重链CDR3，D是所述抗体的重链恒定结构域中的CH1结构域，E是与CD3特异性结合的抗体的轻链可变结构域，所述结构域包含SEQ ID NO：31的轻链CDR1、SEQ ID NO：32的轻链CDR2和SEQ ID NO：33的轻链CDR3，F是所述抗体的轻链恒定结构域，G是与CD3特异性结合的抗体的重链可变结构域，所述结构域包含SEQ ID NO：34的重链CDR1、SEQ ID NO：35的重链CDR2和SEQ ID NO：36的重链CDR3，H是所述抗体的重链恒定结构域中的CH1结构域，I是Fc区或其变体，并且L1、L2、L3和L4中的每一个均是肽接头。2.权利要求1所述的第一融合蛋白，其中L1、L2、L3和L4中的每一个均是由1至50个氨基酸组成的肽接头。3.权利要求1所述的第一融合蛋白，其中L1和L3中的每一个均是由SEQ ID NO：43的氨基酸序列组成的肽接头。4.权利要求1所述的第一融合蛋白，其中L2是由SEQ ID NO：44的氨基酸序列组成的肽接头。5.权利要求1所述的第一融合蛋白，其中L4是由SEQ ID NO：45的氨基酸序列组成的肽接头。6.权利要求1所述的第一融合蛋白，其中所述第一融合蛋白由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。7.第二融合蛋白，其具有以下结构式2：[结构式2]N
′‑
A
‑
B
‑
L1
‑
C
‑
D
‑
L5
‑
J
‑
C
′
其中N
’
是所述融合蛋白的N端，C
’
是所述融合蛋白的C端，A是与间皮素特异性结合的抗体的轻链可变结构域，所述结构域包含SEQ ID NO：25的轻链CDR1、SEQ ID NO：26的轻链CDR2和SEQ ID NO：27的轻链CDR3，B是所述抗体的轻链恒定结构域，C是与间皮素特异性结合的抗体的重链可变结构域，所述结构域包含SEQ ID NO：28的重链CDR1、SEQ ID NO：29的重链CDR2和SEQ ID NO：30的重链CDR3，
D是所述抗体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：林良美，李世奈，元锺和，朴用礼，尹爱吝，李秀娥，林玉宰，林昭贞，金妏经，
申请(专利权)人：财团法人牧岩生命科学研究所，
类型：发明
国别省市：