针对L1CAM的单域抗体及其衍生蛋白和应用制造技术

本发明专利技术属于免疫学领域，涉及针对L1CAM的单域抗体及其衍生蛋白和应用。所述的单域抗体由重链构成，重链包括重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；所述的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列为（1）、（2）、（3）或者（4）的序列组合或与其同源性高的序列。本发明专利技术使用生物基因工程技术筛选出特异性针对L1CAM单域抗体，这些抗体初步亲和力明显，并且具有阻断特定细胞释放细胞因子，通过原核表达即具有良好的结合活性，具有一定的成药性。具有一定的成药性。具有一定的成药性。

【技术实现步骤摘要】
针对L1CAM的单域抗体及其衍生蛋白和应用


[0001]本专利技术属于免疫学领域，涉及针对L1CAM的单域抗体及其衍生蛋白和应用。

技术介绍

[0002]肿瘤的发生是一个多因素、多阶段的演进过程，近年来研究发现，L1CAM(L1细胞黏附分子， L1
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cell adhesion molecule)在人类多种恶性肿瘤中表达增高，并与肿瘤的进展、转移、侵袭、预后密切相关，是肿瘤治疗的潜在靶点。分子靶向治疗相对于手术、放化疗三大传统治疗手段更具有“治本”的功效，具有能效高并选择性杀伤肿瘤细胞特点，减少对正常组织损伤。分子靶向相对其他治疗，带来的副作用较少，更有针对性的治疗肿瘤。
[0003]L1CAM是
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种细胞黏附受体，属于神经细胞黏附分子，是免疫球蛋白超家族中的一员。L1CAM 作为成熟期、非有丝分裂期的细胞黏附受体运行，除了在神经系统的发育及生理过程中起重要作用， L1CAM还存在于许多肿瘤组织中，参与多种类型肿瘤的增殖、扩散、转移和侵袭。在结肠癌的研究中， L1CAM呈现高表达。在70％的结肠癌中可以检测到L1CAM，而在正常的结肠组织中无表达。当L1CAM 引入缺乏L1CAM的结肠癌细胞，这些细胞则变得具有侵袭、转移能力，在裸鼠体内的肝脏形成了大体转移灶，其分子机制为L1CAM的胞外域裂解可以促进转移机制的形成。在乳腺癌中，L1CAM的表达使细胞逃避凋亡，L1CAM可以促进细胞运动，其机制不是依赖于ERK，而是因为细胞之间的黏附连接丢失。在乳腺癌MCF7细胞系中，L1CAM的过度表达导致细胞之间的黏附连接中断，细胞离散，增加了β
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catenin
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TCF的转录活动。但给予siRNA基因抑制时，内源性的L1CAM表达明显减少，MCF7 细胞运动减少，细胞聚集。在卵巢癌中，在各种组织类型中79％表达L1CAM与结肠癌相似，L1CAM 的表达与卵巢癌的不良预后和转移存在密切关系。L1CAM可通过金属蛋白酶裂解形成mL1CAM和 sL1CAM。mL1CAM高表达水平可抑制抑癌基因p53活化，并与能否行满意的卵巢癌肿瘤细胞减灭术密切相关。卵巢癌患者的血清和腹水细胞可检测到可溶性L1CAM(sL1CAM)。sL1CAM已被证明是一个与临床病理类型及患者预后密切的诊断标记物，其高表达预示对化疗的敏感度降低及预后不良，在体外可以促进细胞迁移，侵袭和保护细胞凋亡。L1CAM的过表达使得IL
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1β的分泌增加并诱导NF
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kB 持续活化，因此肿瘤细胞裂解物水平可间接通过IL
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1β水平测定。在肾细胞癌中，46％的透明细胞性肾细胞癌和28％的乳头状肾癌表达L1CAM，正常肾脏通常不表达L1CAM。在透明细胞癌中，L1CAM 的表达与肿瘤转移机制相关，通过联合cyclinD1表达的缺失的多因素分析，L1CAM被定义为肿瘤发生转移的独立预后因素。在各种人体皮肤恶性黑色素瘤的组织学亚型中，L1CAM的阳性表达率为42％，其阳性表达证明L1CAM与转移性疾病相关，成为黑色素瘤患者评价预后的一个积极预测因子。在甲状腺癌中，KoonSoonKim等通过免疫组化方法检测L1CAM表达水平，发现在正常甲状腺上皮细胞及甲状腺分化癌中无表达。在甲状腺未分化肿瘤(ATC)中存在明显的过表达。
[0004]LI
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CAM的作用机制除与细胞黏附有关外，还与信号传导通路有关，如图1。LI
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CAM与受体的结合能在胞内启动信号的传递并与其它受体的信号途径实现对接。在癌细胞中，L1CAM可以结合到酪氨酸激酶受体(RTKs)及整合蛋白，导致细胞外信号调节激酶(ERK)活
化，从而促进细胞周期进程，诱导血管生成和通过激活磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路或BCL
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2途径来诱导细胞凋亡。新的研究显示L1CAM的下游信号除MAKPs/ERK外，还可通过两个旁路信号途径：“正向”信号通过调节性膜内蛋白水解和“反向”信号通过转录因子的核因子(NF)
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kB7。目前就L1CAM的作用机制并没用统一的定论，但更多地倾向于Wnt/β
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catenin信号通路。Wnt信号通路的异常活化在各种肿瘤的增殖﹑侵袭和转移过程中起着至关重要的作用。正常成熟细胞中Wnt信号通路处于抑制状态，大部分细胞质β
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catenin与E
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cadherin结合参与细胞黏附，从而维持细胞的稳定性。少量游离的β
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catenin 被GSK
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3p磷酸化而被降解，使细胞质β
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catenin保持在极低浓度，Wnt/3
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catenin信号通路信号通过细胞质内游离的变异β
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catenin的过度聚积并进入细胞核，与TCF/Lef结合而激活相应的靶基因如c
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myc 基因、cyclinD1的转录过程，从而调控细胞的增殖与凋亡，参与肿瘤的发生。β
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catenin作为Wnt信号通路的细胞黏附和信号转导分子，其水平除受β
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catenin基因突变影响外，还受β
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catenin的降解复合体，如L
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CAM、APC、Axin、GSK
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33、CK1，细胞黏附受体CD44、uPAR、MMPs、细胞外短阵结构等基因影响，能够调节靶基因表达，使得晚期肿瘤细胞变得更具浸润性及转移性。
[0005]由于L1CAM是存在于细胞表面，根据这个特性，从细胞外部对它进行治疗干预，通过加入针对 L1CAM细胞外结构域进行干预的抗体，在细胞培养中能够有效地对肿瘤细胞起到抑制作用，将更大程度地杀伤肿瘤细胞。研究显示，在正常的乳腺上皮细胞中不表达L
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CAM(大多数其他正常组织的上皮组织细胞也不存在表达)，因此在培养基中(甚至在有机体中)加入抗L1CAM抗体对细胞及组织无作用，而抗L1CAM细胞外区域的抗体有效地抑制乳腺癌细胞的增殖。在人类结肠癌细胞系SW480和 HCT116中，当抗L
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CAM抗体加入到培养基中，细胞的侵袭及转移能力均下降。通过向表达L1CAM 的卵巢癌细胞的裸鼠腹腔注射抗L1CAM抗体可有效抑制肿瘤细胞的腹膜播散，因此，在裸鼠上证明，抗L1CAM抗体的治疗可有效抑制肿瘤细胞增长。其他的研究已经证明L1CAM抗体也能够直接应用于表达L1CAM的癌细胞的化学治疗和放射治疗中。当放射性元素铜
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67与抗L1CAM抗体的单克隆抗体结合，注入到种植有SKOV3ip的卵巢癌细胞的裸鼠腹膜中，可见正常组织的放射元素积累量较低，而肿瘤组织放射元素量水平高。这种治疗结果证实裸鼠体内SKOV3ip卵巢癌细胞本质上的受到抑制，并延长裸鼠的生存期。
[0006]综上所述，可以通过单克隆抗体的应用将L1CAM作为分子靶向治疗的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.针对L1CAM的单域抗体，其特征在于：所述的单域抗体由重链构成，重链包括重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；所述的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列为下述（1）、（2）、（3）或者（4）：（1）SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:12所示的CDR2，SEQ ID NO:17所示的CDR3；（2）SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:13所示的CDR2，SEQ ID NO:17所示的CDR3；（3）SEQ ID NO:11所示的CDR1，SEQ ID NO:14所示的CDR2，SEQ ID NO:16所示的CDR3；（4）SEQ ID NO:9所示的CDR1，SEQ ID NO:15所示的CDR2，SEQ ID NO:16所示的CDR3。2.根据权利要求1所述的针对L1CAM的单域抗体，其特征在于：所述的单域抗体的框架区FR的序列为下述（a）、（b）、（c）或者（d）；（a）SEQ ID NO:20所示的FR1，SEQ ID NO:21所示的FR2，SEQ ID NO:24所示的FR3，SEQ ID NO:28所示的FR4，或其变体，所述变体在所述FR中包含至多3个氨基酸的替换；（b）SEQ ID NO:18所示的FR1，SEQ ID NO:21所示的FR2，SEQ ID NO:25所示的FR3，SEQ ID NO:28所示的FR4，或其变体，所述变体在所述FR中包含至多3个氨基酸的替换；（c）SEQ ID NO:19所示的FR1，SEQ ID NO:23所示的FR2，SEQ ID NO:26所示的FR3，SEQ ID NO:28所示的FR4，或其变体，所述变体在所述FR中包含至多3个氨基酸的替换；（d）SEQ ID NO:19所示的FR1，SEQ ID NO:22所示的FR2，SEQ ID NO:27所示的FR3，SEQ ID NO:28...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏志鹏，孟巾果，王乐飞，张云，
申请(专利权)人：南京融捷康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：