转化的人细胞及其用途制造技术

本发明专利技术涉及转化的人细胞及其用途，更具体地，涉及一种通过使用借助向导RNA的基因表达抑制系统，用编码MHC I细胞膜受体和MHC II细胞膜受体的基因转化的细胞，及其用途。这种转化细胞即使在体内也可以有效地表现出细胞的治疗效果，并且不会被体内免疫应答除去。因此，期望包含该免疫细胞作为活性成分的组合物可以有效地用于癌症、传染病、退行性疾病、或免疫性疾病的治疗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】转化的人细胞及其用途
本专利技术涉及转化的人细胞及其用途，并且更具体地，涉及通过向导RNA转化的人细胞及其用途。
技术介绍
作为用于治疗癌症或传染病的方法，利用患者的免疫功能的免疫疗法引起了关注。免疫疗法意指通过免疫细胞(例如，NK细胞、T细胞、树突细胞等)的相互作用而用于疾病的治疗方法。在这些治疗方法中，出现了免疫疗法，其使用了表达对抗原具有特异性的嵌合抗原受体的基因修饰的T细胞。另外，据报道，通过离体活化而具有高细胞毒性的NK细胞显示出对血液癌(例如白血病)的优异治疗作用(BloodCellsMolecules&Disease,33:p261-266,2004)。同时，尽管如上所述免疫细胞有可能用作癌症或传染病的治疗剂，但是与那些健康个体相比，存在于患者体内的免疫细胞在功能和数量方面明显较低。因此，利用同种异体免疫细胞的移植比使用自体免疫细胞更有效。然而，在移植同种异体免疫细胞的情况下，可能会发生一些问题，例如移植排斥或由于体内非己识别而引起的免疫学消除。因此，为了克服这些缺点，需要将同种异体免疫细胞制成细胞库同时允许同种异体免疫细胞被识别为自身的替代方案。
技术实现思路
技术问题为了解决上述问题，专利技术人已合成了向导RNA，该向导RNA在细胞中靶向编码MHCI细胞膜受体的基因和编码MHCII细胞膜受体的基因的向导RNA。另外，专利技术人已使用抑制基因表达的组合物制备了一种细胞，在该细胞中MHCI细胞膜受体和MHCII细胞膜受体的表达受到抑制，该抑制基因表达的组合物包含向导RNA和RNA引导的核酸内切酶作为活性成分，其中可以将HLA-E引入组合物中，从而防止对细胞的体内免疫学消除。因此，本专利技术的目的是提供靶向编码MHCI细胞膜受体的基因和编码MHCII细胞膜受体的基因的向导RNA，并提供使用该向导RNA转化的细胞。解决方案为了实现上述目的，本专利技术提供了：与编码β2-微球蛋白(B2M)的核酸序列互补结合的向导RNA，该向导RNA包含选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:6、SEQIDNO:17、以及SEQIDNO:26组成的组的任何一个核酸序列；与编码HLA-DQ的核酸序列互补结合的向导RNA，该向导RNA包含选自由SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:87、以及SEQIDNO:90组成的组的任何一个核酸序列；与编码HLA-DP的核酸序列互补结合的向导RNA，该向导RNA包含SEQIDNO:123或SEQIDNO:129的核酸序列；以及与编码HLA-DR的核酸序列互补结合的向导RNA，该向导RNA包含选自由SEQIDNO:186、SEQIDNO:188、和SEQIDNO:225组成的组的任何一个核酸序列。另外，本专利技术提供了用于抑制基因表达的组合物，该组合物包含作为活性成分的向导RNA或编码该向导RNA的核苷酸序列、以及RNA引导的核酸内切酶或编码该RNA引导的核酸内切酶的核苷酸序列。另外，本专利技术提供了转化细胞，在所述转化细胞中MHCI细胞膜受体和MHCII细胞膜受体的表达受到抑制。另外，本专利技术提供了用于治疗癌症、传染病、退行性疾病、遗传性疾病、或免疫性疾病的药物组合物，该药物组合物包含作为活性成分的转化细胞；以及用于治疗癌症、传染病、退行性疾病、遗传性疾病、或免疫性疾病的方法，该方法包括向对象施用该组合物。另外，本专利技术提供了转化细胞在用于治疗癌症、传染病、退行性疾病、遗传性疾病、或免疫性疾病中的用途，其中MHCI细胞膜受体和MHCII细胞膜受体的表达在该转化细胞中受到抑制，并且该转化细胞在细胞膜表面上表达结合至修饰的MHCI细胞膜受体的肽抗原，例如G肽。本专利技术的有益效果通过使用利用根据本专利技术的向导RNA的基因表达抑制系统，可以制备这样的细胞：在该细胞中编码MHCI细胞膜受体的基因和编码MHCII细胞膜受体的基因进行了修饰。另外，可以将与肽抗原(例如G肽)结合的HLA-E额外引入细胞中。如上所述的转化细胞甚至在体内也可以有效地显示其治疗功效，并且不会被体内免疫应答消除。因此，期望包含该细胞作为有效成分的组合物可以有效地用于癌症、传染病、退行性疾病、遗传性疾病、或免疫性疾病的治疗。附图说明图1示出了通过使用流式细胞术分析使用靶向B2M的gRNA制备的细胞中的HLA-ABC阴性细胞得到的结果；图2示出了通过使用流式细胞术分析使用靶向HLA-DRA的gRNA制备的细胞中的HLA-DR阴性细胞得到的结果；图3示出了通过使用流式细胞术分析通过使用靶向HLA-DQA的gRNA制备的细胞中的HLA-DQ阴性细胞得到的结果；图4示出了通过使用流式细胞术分析使用靶向HLA-DPA的gRNA制备的细胞中的HLA-DP阴性细胞得到的结果；图5示出了依赖于靶向B2M的gRNA的HLA-ABC阴性细胞系的产率；图6示出了依赖于靶向DRA的gRNA的HLA-DR阴性细胞系的产率；图7示出了依赖于靶向DQA的gRNA的HLA-DQ阴性细胞系的产率；图8示出了依赖于靶向DPA的gRNA的HLA-DP阴性细胞系的产率；图9示出了用靶向B2M的gRNA制备的细胞系中编码B2M的核酸中的突变；图10示出了用靶向HLA-DRA的gRNA制备的细胞系中编码HLA-DRA的核酸中的突变；图11示出了用靶向HLA-DQA的gRNA制备的细胞系中编码HLA-DQA的核酸中的突变；图12示出了用靶向HLA-DPA的gRNA制备的细胞系中编码HLA-DPA的核酸中的突变；图13示出了细胞分离后的HLA-1阳性NK-92MI细胞系和HLA-1阴性NK-92MI细胞系；图14示出了对HLA-1阳性NK-92MI细胞系和HLA-1阴性NK-92MI细胞系的细胞杀伤能力的评估结果；图15示出了通过使用gRNA对CD4T细胞、CD8T细胞和NK细胞进行转化然后用流式细胞术进行分析得到的结果；图16示出了单个gRNA转化的细胞和多个gRNA转化的细胞中靶标的缺失效率；图17比较了单个gRNA转化的细胞、多个gRNA转化的细胞、以及对照组细胞之间的细胞生长率；图18比较了HLA-I阳性T细胞和HLA-I阴性T细胞之间的细胞因子生产能力；图19比较了HLA-I阳性NK细胞和HLA-I阴性NK细胞之间的细胞因子生产能力；图20示出了NK细胞对HLA-I阳性Raji细胞系和HLA-I阴性Raji细胞系的细胞杀伤能力的评估结果；图21示出了负载有G肽的HLA-E的示意图以及用于表达其的蛋白质的结构；图22示出了对通过转导而在K562细胞系中表达的HLA-E进行分析而得到的结果；图23示出了NK细胞对表达HLA-E的K562细胞系(K562G-B2M-HLA-E)和对照组K562细胞系(K562)的细胞杀伤能力的评估结果。具体实施方式在本专利技术的一个方面，提供与编码β2-微球本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.向导RNA，所述向导RNA与编码β2-微球蛋白(B2M)的核酸序列互补结合，所述向导RNA包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:17、以及SEQ ID NO:26组成的组的任何一个核酸序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171116 US 62/587,0681.向导RNA，所述向导RNA与编码β2-微球蛋白(B2M)的核酸序列互补结合，所述向导RNA包含选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:6、SEQIDNO:17、以及SEQIDNO:26组成的组的任何一个核酸序列。


2.向导RNA，所述向导RNA与编码HLA-DQ的核酸序列互补结合，所述向导RNA包含选自由SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:87、以及SEQIDNO:90组成的组的任何一个核酸序列。


3.向导RNA，所述向导RNA与编码HLA-DP的核酸序列互补结合，所述向导RNA包含SEQIDNO:123或SEQIDNO:129的核酸序列。


4.向导RNA，所述向导RNA与编码HLA-DR的核酸序列互补结合，所述向导RNA包含选自由SEQIDNO:186、SEQIDNO:188和SEQIDNO:225组成的组的任何一个核酸序列。


5.用于抑制基因表达的组合物，所述组合物包含以下作为活性成分：
根据权利要求1至4中任一项所述的向导RNA或编码所述向导RNA的核苷酸序列；和
RNA引导的核酸内切酶或编码所述RNA引导的核酸内切酶的核苷酸序列。


6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述RNA引导的核酸内切酶是任何一个选自由以下组成的组的RNA引导的核酸内切酶：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Cpf1、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、以及Csf4。


7.转化细胞，在所述转化细胞中MHCI细胞膜受体和MHCII细胞膜受体的表达受到抑制。


8.根据权利要求7所述的转化细胞，其特征在于，所述转化细胞在所述细胞膜表面上表达肽抗原。


9.根据权利要求8所述的转化细胞，其特征在于，所述肽抗原为G肽。


10.根据权利要求9所述的转化细胞，其特征在于，所述G肽结合至修饰的MHCI细胞膜受体。


11.根据权利要求10所述的转化细胞，其特征在于，所述修饰的MHCI细胞膜受体具有HLA-E与B2M连接的结构。


12.根据权利要求11所述的转化细胞，其特征在于，在所述修饰的MHCI细胞膜受体中，所述B2M的C端经由第一接头连接至所述HLA-E的α1的N端，并且所述G肽的C端经由第二接头连接至所述B2M的N端。

【专利技术属性】
技术研发人员：林玉宰，金妏径，李允贞，李智园，梁佑锡，金侑映，权瑛银，崔承贤，
申请(专利权)人：财团法人牧岩生命科学研究所，
类型：发明
国别省市：韩国;KR