使用突变型p53特异性siRNA进行癌症治疗性靶向制造技术

本文披露了用于靶向p53基因内的一个或多个点突变的核酸序列。特别地，p53中的点突变位点选自由以下组成的组：R249、R248、R273和R175。本文还披露了用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文披露的一种或多种核酸序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用突变型p53特异性siRNA进行癌症治疗性靶向相关申请的交叉引用本申请要求于2018年2月21日提交的新加坡临时申请号10201801432S的优先权权益，出于所有目的将其内容通过引用以其全文特此并入。专利
本专利技术总体上涉及分于生物学领域。特别地，本专利技术涉及使用生物标记进行检测和诊断，以及使用siRNA来治疗癌症。专利技术背景通过泛癌基因组测序工作，已经在几乎所有癌症类型中鉴定了大量基因组改变。这导致将这些突变中的许多突变鉴定并关联为偶然参与癌症发展的潜在驱动因素。通过开发抑制性分子或封闭性抗体，已对癌基因中的一些已鉴定的改变进行了治疗性靶向，这在治疗带有这些突变的癌症方面已取得了巨大的初步成功，形成了肿瘤学精准医疗的基础。然而，使用抑制剂或封闭性抗体进行治疗性靶向的这种方法的一个挑战是它们对蛋白质的突变型形式不是完全特异的，而是相对于其野生型(WT)对应物在表达突变型蛋白的细胞中是更为有效的(这是由于突变型蛋白的活性或表达升高)。结果，这可能导致对表达WT蛋白的多种细胞类型产生不良副作用。因此，针对突变蛋白的理想药物应该是仅影响突变型形式的功能而不对WT型产生任何影响的药物。然而，到目前为止，还没有产生具有如此高特异性的药物或分子。尽管如此，但到目前为止，尚无可用的产生“仅突变体”特异性试剂的常规技术。精准医疗时代促进了许多药物的发展，这些药物对蛋白质的高活性突变型形式具有特异性。尽管最初已经取得了令人瞩目的成果，但仍存在关于特异性的两大问题。首先，针对特定蛋白质(通常是激酶)产生的药物几乎总是对其他细胞靶标有影响。而且，尽管这些药物中的许多药物对蛋白质的突变型形式和活性形式非常有效，但对野生型对应物也有重大影响，如针对c-Kit所显示的。因此，尽管这些抑制剂是有效的，但其对野生型形式或其他紧密相关的靶标的影响将持续导致不良副作用，从而降低这些试剂的前景。因此，需要对蛋白质的突变形式具有高特异性并且与野生型形式几乎没有或没有交叉反应性的试剂，用于治疗过度增生性疾病。专利技术概述在一方面，本专利技术涉及用于靶向靶基因内的单点突变的核酸序列，其中该靶基因是一个或多个肿瘤抑制基因；其中该肿瘤抑制基因是p53，并且其中该点突变的位点选自由以下组成的组：R249(p53)、R248(p53)、R273(p53)和R175(p53)。在另一方面，本专利技术涉及治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用如本文披露的一种或多种核酸序列，其中这些核酸序列靶向靶基因内的一个或多个点突变位点，其中该靶基因是肿瘤抑制基因。在又另一方面，本专利技术涉及鉴定对治疗敏感的受试者的方法，其中该方法包括：i)鉴定靶基因内的一个或多个单点突变，其中该靶基因是一个或多个肿瘤抑制基因；其中该肿瘤抑制基因是p53，并且其中该一个或多个点突变的位点选自由以下组成的组：R249(p53)、R248(p53)、R273(p53)和R175(p53)；ii)向该受试者施用如本文披露的一种或多种核酸序列，其中这些核酸序列靶向靶基因内的一个或多个点突变位点，其中该靶基因内的一个或多个点突变的存在表明该受试者对治疗敏感。附图说明当结合非限制性实例和附图考虑时，参考详细说明将更好地理解本专利技术，其中：图1提供了示出了通过siRNA步移选择的siRNA序列可特异性靶向各种p53热点突变体的数据。(A)示出了野生型(WT)的核苷酸序列，并且在每种情况下指示了各自的p53突变体(即R175H；R248W；R249S和R273H)，随后指示了筛选后以靶向每个突变体的p53等位基因特异性siRNA序列。WT核苷酸残基和突变核苷酸残基均以粗体突出显示。在底部指示了泛p53siRNA(si-p53)和乱序(scr)siRNA(si-scr)序列。(B)示出了针对(A)中所示的每个siRNA进行的免疫印迹的图像。将每个siRNA转染到稳定表达指示的p53突变体的同基因H1299细胞系中。然后，在转染后72小时，使用抗p53抗体(DO-1)通过免疫印迹分析细胞裂解物的p53表达。将表达温度敏感的(TS)WTp53的细胞用作WT对照。用星号(“*”)指示显示出特异的和改善的敲低活性的突变体特异性siRNA。示出了至少三个独立实验中的一种代表性印迹。肌动蛋白显示为上样对照，并且(-)仅代表未进行任何siRNA转染的细胞。对于每个样品，计算p53与肌动蛋白条带强度的比率，并将其标准化为si-scr对照的比率。数值代表标准化倍数变化。图2描绘了免疫印迹数据，其示出了突变体特异性siRNA对内源性突变型p53的沉默效力。小图(A)至(D)示出了分别针对R175H、R248W、R249S和R273H的siRNA的免疫印迹结果。突变型siRNA在具有WTp53表达的三个细胞系和表达指示的p53突变体的三个细胞系中转染。如上所述通过免疫印迹评估沉默效力。示出了至少三个独立实验中的一种代表性印迹。细胞系的突变型p53状态在印迹下方突出显示，并在表1中进行描述。图3呈现了流式细胞术图，其示出了突变型p53表达的等位基因特异性沉默导致细胞死亡。在指示的细胞系中转染指示的siRNA72小时后，对细胞中亚G1DNA含量(指示细胞凋亡)的流式细胞术分析进行定量。从至少三个独立重复中的一个实验中示出了代表性直方图。直方图(M1)中指示了亚G1细胞的％。图4提供了说明了突变型p53特异性沉默导致在表达突变型p53的细胞中p53经典靶基因的激活的直方图。(A)示出了用靶向四个热点p53突变体的siRNA或对照乱序siRNA或p53特异性siRNA瞬时转染表达WTp53的HCT116细胞。72小时后收集细胞，用于通过定量实时PCR对指示的靶基因进行mRNA分析。(B)示出了以相似的方式转染并分析表达指示的p53突变体的AU565、786-O、BT549和ASPC1细胞系。示出了靶基因的相对表达。所有实验均标准化为GAPDH，并一式三份进行。条形图示出了三个独立实验的平均值±标准偏差。*表示p值<0.05，**表示<0.005；并且***表示<0.001，其中n＝3个样品/组。图5示出了描绘突变型p53特异性shRNA的生长抑制作用的数据。(A)示出了指示的细胞系的免疫印迹，将这些细胞系用表达泛p53(sh-p53)shRNA的shRNA、乱序对照、各自的突变特异性shRNA或空载体(-)转染。48小时后收获细胞，并通过免疫印迹分析这些细胞的沉默效率。(B)示出了shRNA转染5天后用结晶紫溶液染色并观察的细胞集落的平行培养物的图像。从至少三个独立实验(b)中的一个实验中示出了代表性图像并进行量化。图6描绘了显示通过突变型p53特异性沉默而使突变型p53的显性负效应缓解的数据。(A)示出了用对照、泛p53(sh-p53)或R248W特异性shRNA(sh-4)转染的RKO+/-和RKO+/248W细胞的免疫印迹，并如上所述分析了这些细胞的沉默效力。关于集落生长的数据在小图(B)中示出，并且p53靶基因表达分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于靶向靶基因内的单点突变的核酸序列，其中所述靶基因是一个或多个肿瘤抑制基因；其中所述肿瘤抑制基因是p53，并且其中所述点突变的位点选自由以下组成的组：R249(p53)、R248(p53)、R273(p53)和R175(p53)。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180221 SG 10201801432S1.一种用于靶向靶基因内的单点突变的核酸序列，其中所述靶基因是一个或多个肿瘤抑制基因；其中所述肿瘤抑制基因是p53，并且其中所述点突变的位点选自由以下组成的组：R249(p53)、R248(p53)、R273(p53)和R175(p53)。


2.如权利要求1所述的核酸序列，其中所述点突变选自由以下组成的组：R249S(p53)、R249G(p53)、R249M(p53)、R248W(p53)、R248Q(p53)、R273H(p53)、R273L(p53)和R175H(p53)。


3.如前述权利要求中任一项所述的核酸序列，其中所述核酸序列导致以下作用中的任何一种或多种，这些作用选自由以下组成的组：细胞死亡、成瘾的消除、靶基因中的任何一个或多个的激活、显性负效应的缓解、对一种或多种抗癌剂的敏感性增加、以及肿瘤生长的阻滞或停止。


4.如前述权利要求中任一项所述的核酸序列，其中所述核酸序列能够基本上沉默突变型肿瘤抑制基因等位基因。


5.如前述权利要求中任一项所述的核酸序列，其中所述点突变是取代突变。


6.如前述权利要求中任一项所述的核酸序列，其中所述核酸序列是RNA序列。


7.如权利要求6所述的核酸序列，其中所述RNA序列是小干扰RNA(siRNA)序列或短发夹RNA(shRNA)序列。


8.如权利要求7所述的核酸序列，其中所述siRNA序列在15至150个碱基对之间。


9.如权利要求7所述的核酸序列，其中所述shRNA序列包含长度在15至30个碱基对之间的茎。


10.如前述权利要求中任一项所述的核酸序列，其中所述核酸序列选自由以下组成的组：SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.36、SEQIDNO.37、SEQIDNO.38、SEQIDNO.39、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.44、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15、SEQIDNO.45、SEQIDNO.46、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17、SEQIDNO.19、SEQIDNO.47、SEQIDNO.20、SEQIDNO.21、SEQIDNO.24/40/41、SEQIDNO.25/42/43、SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28、SEQIDNO.29、SEQIDNO.30、SEQIDNO.31、SEQIDNO.32、和SEQIDNO.33。


11.如前述权利要求中任一项所述的核酸序列，其中所述核酸序列选自由以下组成的组：SEQIDNO.9、SEQIDNO.13、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17、和SEQIDNO.21。


12.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1至11中任一项所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡纳加·萨芭帕蒂，
申请(专利权)人：新加坡保健服务集团有限公司，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG