抗体文库和使用抗体文库的抗体筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种新型抗体文库和一种使用所述新型抗体文库的抗体筛选方法。具有源自人类序列的特异性VH或VL支架的根据本发明专利技术的抗体文库展现出高热力学稳定性，并且具有允许高可溶性表达以及可逆折叠的优点。另外，根据本发明专利技术的抗体包含多种经合理控制的CDR，以对所有抗原展现出高特异性和高亲和力，并且因此可以有利地用于选择针对靶抗原的适当的候选抗体。体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗体文库和使用抗体文库的抗体筛选方法


[0001]本专利技术涉及一种新型抗体文库和使用所述抗体文库的抗体筛选方法，其中根据本专利技术的抗体文库具有某些源自人类序列的VH或VL支架，并因此具有展现出高热力学稳定性和实现高可溶性表达和可逆折叠的优势。
[0002]另外，根据本专利技术的抗体文库含有多种CDR，所述多种CDR被合理控制为对所有抗原具有高特异性和高亲和力并因此可用于选择候选抗体。

技术介绍

[0003]抗体是通过刺激免疫系统中白细胞的B细胞(B淋巴细胞)中的抗原而产生的蛋白质。当抗体遇到抗原时，它通过细胞中存在的受体识别抗原，并使用所述受体与抗原结合。这种抗体被视为用于治疗疾病的新蛋白质药物的候选物，并且产生了多种抗体文库，并且从所述抗体文库筛选出抗体以找到目的功能性抗体。
[0004]这种抗体文库使用基因重组技术。从人体中存在的B细胞提取编码抗体蛋白质的基因，以产生抗体基因文库，并从这些文库选择具有所需抗原结合特异性的抗体。抗体文库技术已经彻底改变了抗体(如人类抗体)的产生。抗体免疫应答的最突出特征是，无论侵入身体的外部抗原的种类或形状如何，如果所述抗原是与身体中的成分不同的外来物质，则会在一周内产生与所述抗原特异性结合的抗体。
[0005]抗体由B淋巴细胞产生，并且一个B淋巴细胞仅产生一种类型的抗体。实际上，人体中存在多种类型的B淋巴细胞，每种类型的B淋巴细胞在细胞膜上表达具有其自身独特的抗原结合特异性的抗体，并且已知人体中存在大约108种抗原结合多样性。当抗原侵入时，只有表达与所述抗原特异性结合的抗体的B淋巴细胞迅速增殖并产生大量抗体。作为结果，这种特异性抗体在血清中的浓度迅速增加，并执行快速去除所述侵入抗原的功能。因此，人体中存在数以亿计的抗体多样性，并且这种抗体多样性被称为“抗体库”。
[0006]因此，通过采血从人体获得足够数量的B淋巴细胞，从这些细胞分离出mRNA，并且然后通过RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)获得编码抗体重链和轻链可变区的cDNA。作为结果，可以以相对简单的方式以基因的形式在体外获取人体中的抗体库。抗体文库技术的核心是将这种人类抗体基因库表达(或展示)为蛋白质，编码所述抗体蛋白质的基因通过任何方式连接，即所谓的基因型-表型连接，并以此为基础，从所述抗体文库选择与特异性抗原结合的抗体，并且同时获得编码所述特异性抗体的基因。
[0007]在此，不需要完全的免疫，并且表达了具有抗原结合功能的抗体的Fab形式，或者表达了被称为“scFv(单链可变片段)”的抗体片段，其中重链和轻链可变结构域(VH和VL)通过约15个氨基酸的短肽接头连接。在这种情况下，将抗体文库技术根据具有表面的介质分为噬菌体展示、核糖体展示、酵母展示等，在用于基因型-表型连接的介质的表面上表达抗体，并且可以在无需诱导免疫应答(如抗原施用)的情况下获得具有所需抗原结合特性的抗体。
[0008]然而，缺点在于抗体文库产生和抗体筛选需要大量的专业技术，并且由于难以获
得高亲和力抗体，常常在抗体筛选后进行抗体优化过程(如亲和力成熟化)，并且不利的是，由于诸如初步筛选期间的毒性的问题，无法在哺乳动物细胞中直接进行功能分析。在治疗性抗体的情况下，应选择并非简单地与抗原结合而是具有实际治疗功能的抗体，并且因此这种缺点已变成开发治疗性抗体的障碍。
[0009]噬菌体展示抗体文库是使用最广泛的抗体文库。实际上，当前可商购的Humira(抗TNF-α人类单克隆抗体)是使用噬菌体展示技术产生的治疗性抗体。理想的抗体文库展现出广泛的抗体多样性，并且使得能够随时获得具有所需抗原结合特异性的高亲和力抗体克隆。为此目的，应当产生具有约10
10
至约10
11
的抗体多样性的文库。然而，通过抗体基因克隆很难产生这种大小的文库，并且这是产生噬菌体展示抗体文库中最困难的挑战。另外，存在噬菌体本身充当毒素的缺点，因此无法立即进行功能分析。
[0010]核糖体展示的最大优点在于，它是一个无细胞系统并且因此能够轻松地产生文库，所述文库大到足以在理论上产生大小为10
13
的文库，这对于获得高亲和力抗体是有利的(通常，随着抗体文库大小的增加，文库中含有高亲和力抗体的可能性也会增加)，并且因为存在PCR扩增过程，所以可以使用容易出错的聚合酶，从而引入突变来人工诱导分子进化是非常简单的。然而，由于毒性问题和各种实验问题，事实上，噬菌体展示技术主要用于产生天然抗体文库。
[0011]由于将重组载体插入到酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株中的过程以及酵母细胞的大尺寸，因此酵母展示技术在构建具有109或更高多样性的抗体文库方面存在许多技术局限性。因此，它主要用于构建已经利用选择过程中的优点确保的抗原特异性抗体的突变体文库，并且用于从所述文库选择高亲和力抗体。
[0012]其中噬菌体展示是一种通过在细菌噬菌体表面上表达抗体片段来筛选抗体的技术，并且与常规开发的抗体技术(使用杂交瘤开发嵌合/人源化抗体或使用转基因小鼠开发抗体)相比，具有在短时间内鉴定抗原特异性抗体的优点。噬菌体展示的缺点在于，只有在确保高度多样化的文库时才能鉴定出有效抗体。然而，基因扩增和克隆技术的最新发展已经解决了确保大型文库的问题。
[0013]与基于人类基因的天然文库相比，合成抗体文库是指通过将随机的合成序列引入到抗体的互补决定区(CDR)中而被赋予多样性的抗体文库。然而，与天然人类文库相比，由于突变或移码的影响，合成抗体文库具有较低比例的可正常运行的抗体片段。近年来，使用抗体文库鉴定新型靶抗原的策略已变得多样化，并且其中具有代表性的是，已经使用源自肿瘤的原代细胞通过细胞淘选来鉴定新型抗原特异性抗体(Zhu X.等人,Mol.Cancer Res.2010)。
[0014]如上所述，由于各种方法策略的可能性可以确保连续的抗体候选物，并且可以通过克隆产生抗体，因此噬菌体展示是一种高效的方法策略。使用这种噬菌体展示技术鉴定出的靶向各种类型的癌症的候选抗体药物正在临床试验中。为了鉴定所需的抗体以利用噬菌体展示技术，必须从抗体可变区基因产生文库，并且构建各种文库是必不可少的。
[0015]尽管目前正在开发各种抗体文库，但对于能够选择对各种抗原具有高特异性和高亲和力的抗体的抗体文库的需求仍在增加，因为所述抗体文库具有高热力学稳定性，能够实现高可溶性表达并且具有高多样性。
[0016]在这一技术背景下，作为巨大努力的结果是，诸位专利技术人发现，当从亚洲人种和高
加索人种的cDNA提取出共同序列并基于所述共同序列使用基于特异性VH和/或VL支架的组合的抗体文库时，所选择的抗体具有高热力学稳定性，并且能够实现高可溶性表达和可逆折叠。基于此发现，已完成了本专利技术。
[0017]此外，根据本专利技术的抗体文库含有多种CDR，所述多种CDR被合理地控制和设计为对所有抗原都具有高特异性和高亲和力，因此与天然抗体文库相比展现出优异的多样性和更低的重复序列比率，并且可以有效地用于选择针对靶抗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种抗体或其片段集合，其中每个抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区对，其中所述重链可变区包含：框架区，所述框架区含于选自VH3-15(SEQ ID NO:1)、VH3-23(SEQ ID NO:6)和VH1-69(SEQ ID NO:11)的重链可变区中；以及对于每个重链可变区都不同的重链互补决定区1(CDRH1)、重链互补决定区2(CDRH2)和重链互补决定区3(CDRH3)的组合，并且所述轻链可变区包含：框架区，所述框架区含于选自Vκ1-39(SEQ ID NO:16)、Vκ3-20(SEQ ID NO:21)、Vκ3-20-2(SEQ ID NO:26)和Vλ1-51(SEQ ID NO:31)的轻链可变区中；以及对于每个轻链可变区都不同的轻链互补决定区1(CDRL1)、轻链互补决定区2(CDRL2)和轻链互补决定区3(CDRL3)的组合。2.根据权利要求1所述的抗体或其片段集合，其中所述抗体或其片段集合包含：框架区，所述框架区含于选自VH3-15(SEQ ID NO:1)/Vκ1-39(SEQ ID NO:16)、VH3-15(SEQ ID NO:1)/Vκ3-20(SEQ ID NO:21)、VH3-15(SEQ ID NO:1)/Vκ3-20-2(SEQ ID NO:26)、VH3-15(SEQ ID NO:1)/Vλ1-51(SEQ ID NO:31)、VH3-23(SEQ ID NO:6)/Vκ1-39(SEQ ID NO:16)、VH3-23(SEQ ID NO:6)/Vκ3-20(SEQ ID NO:21)、VH3-23(SEQ ID NO:6)/Vκ3-20-2(SEQ ID NO:26)、VH3-23(SEQ ID NO:6)/Vλ1-51(SEQ ID NO:31)、VH1-69(SEQ ID NO:11)/Vκ1-39(SEQ ID NO:16)、VH1-69(SEQ ID NO:11)/Vκ3-20(SEQ ID NO:21)、VH1-69(SEQ ID NO:11)/Vκ3-20-2(SEQ ID NO:26)和VH1-69(SEQ ID NO:11)/Vλ1-51(SEQ ID NO:31)的重链和轻链可变区对中；以及对于每个重链可变区都不同的CDRH1、CDRH2和CDRH3的组合和对于每个轻链可变区都不同的CDRL1、CDRL2和CDRL3的组合。3.根据权利要求1或2所述的抗体或其片段集合，其中在具有序列VH3-15(SEQ ID NO:1)的所述重链可变区中的所述框架区包含FR1(SEQ ID NO:2)、FR2(SEQ ID NO:3)、FR3(SEQ ID NO:4)和FR4(SEQ ID NO:5)，在具有序列VH3-23(SEQ ID NO:6)的所述重链可变区中的所述框架区包含FR1(SEQ ID NO:7)、FR2(SEQ ID NO:8)、FR3(SEQ ID NO:9)和FR4(SEQ ID NO:10)，在具有序列VH1-69(SEQ ID NO:11)的所述重链可变区中的所述框架区包含FR1(SEQ ID NO:12)、FR2(SEQ ID NO:13)、FR3(SEQ ID NO:14)和FR4(SEQ ID NO:15)，在具有序列Vκ1-39(SEQ ID NO:16)的所述轻链可变区中的所述框架区包含FR1(SEQ ID NO:17)、FR2(SEQ ID NO:18)、FR3(SEQ ID NO:19)和FR4(SEQ ID NO:20)，在具有序列Vκ3-20(SEQ ID NO:21)的所述轻链可变区中的所述框架区包含FR1(SEQ ID NO:22)、FR2(SEQ ID NO:23)、FR3(SEQ ID NO:24)和FR4(SEQ ID NO:25)，在具有序列Vκ3-20-2(SEQ ID NO:26)的所述轻链可变区中的所述框架区包含FR1(SEQ ID NO:27)、FR2(SEQ ID NO:28)、FR3(SEQ ID NO:29)和FR4(SEQ ID NO:30)，并且在具有序列Vλ1-51(SEQ ID NO:31)的所述轻链可变区中的所述框架区包含FR1(SEQ ID NO:32)、FR2(SEQ ID NO:33)、FR3(SEQ ID NO:34)和FR4(SEQ ID NO:35)。4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其片段集合，其中，在所述抗体或其片段中，包含在所述重链可变区和所述轻链可变区的所述对的每个可变区中的互补决定区
(CDR)被设计为通过改变有潜力进行翻译后修饰(PTM)的氨基酸来防止在翻译后发生修饰。5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其片段集合，其中在具有序列VH3-15(SEQ ID NO:1)的所述重链可变区中的所述重链互补决定区1(CDRH1)中的每个位置的氨基酸比率包括表3的范围，在具有序列VH3-15(SEQ ID NO:1)的所述重链可变区中的所述重链互补决定区2(CDRH2)中的每个位置的氨基酸比率包括表4的范围，在具有序列VH3-23(SEQ ID NO:6)的所述重链可变区中的所述重链互补决定区1(CDRH1)中的每个位置的氨基酸比率包括表3的范围，在具有序列VH3-23(SEQ ID NO:6)的所述重链可变区中的所述重链互补决定区2(CDRH2)中的每个位置的氨基酸比率包括表4的范围，在具有序列VH1-69(SEQ ID NO:11)的所述重链可变区中的所述重链互...

【专利技术属性】
技术研发人员：金董植，李美祯，吴美英，崔慧智，金吉重，张信娥，尹爱吝，
申请(专利权)人：财团法人牧岩生命科学研究所，
类型：发明
国别省市：