一种快速、大通量兔多克隆抗体体外生产方法技术

本发明专利技术提供了一种快速、大通量兔多克隆抗体体外生产方法，主要利用B淋巴细胞分离技术，通过体外扩增培养实现兔多克隆抗体的快速、大量和稳定生产，并优化了B淋巴细胞培养基，采用胰蛋白胨并搭配空白兔血清制备B淋巴细胞培养基，大幅提高B淋巴细胞的分化和增殖量，为兔多克隆抗体的体外生产提供细胞量的基础。通过本发明专利技术提供的方法，兔子在第三次免疫后马上可以采血进行生产，产品生产周期大幅缩短，获得的兔多克隆抗体产量是传统方法中同体积血清产量的30倍以上，具有周期短、产量大、单位成本低、质量稳定等优势，适于大规模生产应用。适于大规模生产应用。适于大规模生产应用。

【技术实现步骤摘要】
一种快速、大通量兔多克隆抗体体外生产方法


[0001]本专利技术涉及抗体制备领域，具体而言，本专利技术涉及一种快速、大通量兔多克隆抗体体外生产方法。

技术介绍

[0002]兔多克隆抗体是指兔子的免疫系统由于抗原的刺激作用产生的抗体。而抗原往往是由多个抗原决定簇组成的，一个兔子B淋巴细胞只能接受该抗原的一种抗原决定簇刺激，从而产生一种对应的特异性抗体，这种抗体称之为单克隆抗体(MonoclonalAntibody)。所以多种抗原决定簇刺激兔子免疫系统，对应地就会生产多种特异性单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。兔子免疫系统产生的抗体对于小鼠、大鼠等其他物种有着亲合力强、特异性好、效价高的优势，因此兔多克隆抗体为科研开发、药物筛选和临床诊断提供了最佳抗体试剂来源。
[0003]抗体体外生产是指利用特定人工环境和培养试剂对分泌抗体的细胞或组织进行机体外培养以获得特异性抗体。常见的抗体体外培养技术有杂交瘤细胞培养技术、重组抗体培养技术等，但这种技术往往使用在单克隆抗体生产。
[0004]传统方法的兔多克隆抗体生产方法主要是用抗原大规模免疫兔子，然后在第四次免疫后开始收集20-30ml兔子血清，之后取血都需要重复免疫、休息、采血、休息的循环周期。因此如果收集100ml的兔子血清需要花费105天。且因为兔子健康、寿命等限制，多抗产品往往需要重新免疫新兔子造成产品批次差异大，质量不稳定的问题。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术提供了一种利用B淋巴细胞分离技术，通过体外扩增培养实现兔多克隆抗体的快速、大量和稳定生产的方法，并优化了B淋巴细胞培养基，采用胰蛋白胨并搭配空白兔血清作为特殊添加物，大幅提高B淋巴细胞的分化和增殖量，为兔多克隆抗体的体外生产提供细胞量的基础。通过本专利技术提供的方法，兔子在第三次免疫后马上可以采血进行生产，产品生产周期大幅缩短，获得的兔多克隆抗体产量是传统方法中同体积血清产量的30倍以上，具有周期短、产量大、单位成本低、质量稳定等优势，适于大规模生产应用。
[0006]一方面，本专利技术提供一种快速、大通量兔多克隆抗体体外生产方法，其特征在于，包括步骤：
[0007]1)免疫后的兔子上获得外周血单核细胞悬液；
[0008]2)利用包被抗原的高亲和力平皿获得抗原特异性B淋巴细胞；
[0009]3)获得优化后的B淋巴细胞培养基；
[0010]4)采用步骤3)优化后的B淋巴细胞培养基扩大培养特异性B淋巴细胞；
[0011]5)亲和纯化上清，快速获得大量兔多克隆抗体产品。
[0012]进一步地，步骤3)所述的优化后的B淋巴细胞培养基为：RPMI1640+10％空白兔血
清+1％胰蛋白胨+添加剂A，所述添加剂A为替代Th细胞活化B淋巴细胞的重要细胞因子。
[0013]现有的B细胞培养基为含有10％FBS的RPMI1640，同时加入添加剂A(添加剂A为替代Th细胞活化B细胞的重要细胞因子，例如CD40L、IL6等细胞因子，本专利技术优选使用的添加剂A为CD40L和IL6。
[0014]经优化后的B细胞培养基为：RPMI1640+10％空白兔血清+1％胰蛋白胨+添加剂A。其中的胰蛋白胨作为一种氮源能更好的为合成抗体提供营养，空白兔血清作为富含兔源细胞因子添加剂能更好的刺激兔子B细胞的分裂增殖。
[0015]B细胞分泌抗体时需要消耗大量氨基酸合成蛋白质，因此额外添加了氮源作为补充。我们在细胞培养上最常用的就是MEM Amino Acids和MEM NEAA，直接补充氨基酸，该方法成本高，且兔子B细胞消耗氨基酸比例不明确，可能并不能达到最佳效果。胰蛋白胨作为细菌培养时常用氮源，很少使用在细胞培养上。而我们却发现,胰蛋白胨作为B细胞培养特别有效而且价格低廉的氮源补充试剂。
[0016]另外，培养基优化过程中，考虑到生产兔多克隆抗体需要兔子B淋巴细胞分泌大量抗体，因此在细胞因子方面，通过兔血清替代FBS(胎牛血清)减少血清中细胞因子的种属差异，更好的刺激和活化B细胞。
[0017]本专利技术优化B淋巴细胞培养条件，将胰蛋白胨和空白兔血清作为特殊添加物，对常规培养基进行了优化改进，大幅提高B淋巴细胞的分化和增殖量，为兔多克隆抗体的体外生产提供细胞量的基础。
[0018]进一步地，步骤1)获得第三次免疫后的兔子外周血进行外周血单核细胞悬液的制备。
[0019]进一步地，步骤1)所述外周血单核细胞悬液制备方法为：
[0020]a)在50mL离心管中加入20mL淋巴细胞分离液Ficoll；
[0021]b)取10mL第三次免疫后抗凝兔静脉血与10mL无菌DPBS按照1：1充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上；
[0022]c)水平离心400g
×
30分钟；
[0023]d)用移液管吸取外周血单核细胞(PBMC)加入到50ml离心管中；
[0024]e)加入DPBS定容至45ml，离心300g
×
10分钟，相同条件下，用DPBS洗涤细胞两次；
[0025]f)末次离心后，弃上清，加入含有10％FBS的RPMI1640，重悬细胞，计数。
[0026]进一步地，步骤2)所述包被的抗原为免疫原蛋白、多肽、交联KLH或者BSA的多肽。
[0027]进一步地，步骤2)所述利用包被抗原的高亲和力平皿获得抗原特异性B淋巴细胞的方法为：
[0028]Ⅰ)用0.22μm滤芯过滤抗原，将过滤后的抗原包被高亲平皿，4℃包被过夜；
[0029]Ⅱ)第二天，吸干上清并用10mlPBS洗板两次，用5％FBS/PBS溶液封闭，室温封闭2小时或者37℃封闭30min；
[0030]Ⅲ)将步骤1)中的步骤f)分离得到的外周血单核细胞按照5M/皿的量加入到高亲平皿中，37℃孵育一个半小时；
[0031]Ⅳ)将孵育后的平皿用RPMI1640清洗3次；
[0032]Ⅴ
)收集分离细胞。
[0033]进一步地，步骤4)所述的扩大培养的条件为：抗原特异性B淋巴细胞在37℃的5％
CO2培养箱内的平皿中培养5天，之后转移至锥形培养瓶中，在37℃的5％CO2摇床培养箱继续培养15天，离心收集上清。
[0034]进一步地，步骤5)所述的亲和纯化方法为：采用抗原亲和柱进行亲和层析。
[0035]另一方面，本专利技术提供一种B淋巴细胞培养基，所述B淋巴细胞培养基以胰蛋白胨作为氮源。
[0036]进一步地，B淋巴细胞培养基为：RPMI1640+10％空白兔血清+1％胰蛋白胨+添加剂A，所述添加剂A为替代Th细胞活化B细胞的重要细胞因子，例如CD40L、IL6等细胞因子，本专利技术优选使用的添加剂A为CD40L和IL6。
[0037]进一步地，，所述B淋巴细胞为来源于兔子的外周血单核细胞悬液的抗原特异性B淋巴细胞。
[0038]再一方面，本专利技术提供了胰蛋白胨用于制备B淋巴本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速、大通量兔多克隆抗体体外生产方法，其特征在于，包括步骤：1)免疫后的兔子上获得外周血单核细胞悬液；2)利用包被抗原的高亲和力平皿获得抗原特异性B淋巴细胞；3)获得优化后的B淋巴细胞培养基；4)采用步骤3)优化后的B淋巴细胞培养基扩大培养抗原特异性B淋巴细胞；5)亲和纯化上清，快速获得大量兔多克隆抗体产品。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的优化后的B淋巴细胞培养基为：RPMI1640+10％空白兔血清+1％胰蛋白胨+CD40L+IL6。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)获得第三次免疫后的兔子外周血进行外周血单核细胞悬液的制备。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)所述外周血单核细胞悬液制备方法为：a)在50mL离心管中加入20mL淋巴细胞分离液Ficoll；b)取10mL第三次免疫后抗凝兔静脉血与10mL无菌DPBS按照1：1充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上；c)水平离心400g
×
30分钟；d)用移液管吸取外周血单核细胞加入到50ml离心管中；e)加入DPBS定容至45ml，离心300g
×
10分钟，相同条件下，用DPBS洗涤细胞两次；f)末次离心后，弃上清，加入含有10％FBS的RPMI1640，重悬...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏力，章红芳，程仲毅，潘红阳，
申请(专利权)人：杭州景杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：