利用液态热响应型聚合物EO制造技术

本发明专利技术涉及利用热响应型聚合物环氧乙烷

【技术实现步骤摘要】
利用液态热响应型聚合物EO
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分离纯化单克隆抗体


[0001]本专利技术涉及两水相萃取
，更具体地，涉及可再生型两水相萃取
，特别是指利用单一温敏聚合物构建可回收型两水相体系在单克隆抗体分离纯化过程中的工艺设计与优化。

技术介绍

[0002]可再生两水相体系是利用热响应型聚合物构建两水相体系，通过将热响应型聚合物的高效回收，实现两水相体系的重复再利用。
[0003]环氧乙烷(EO)-环氧丙烷(PO)无规共聚物(EOPO)是一种热响应型聚合物，可根据环氧乙烷与环氧丙烷的比例，调节其亲疏水性合成不同浊点的热响应型聚合物，其中常用包括EO
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、EO
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、EO
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，并可根据分离目标物质的性质选择合适浊点的EOPO。EOPO水溶液通过温度诱导可形成两水相体系，当温度升高至其浊点上15℃，可形成上、下界面清晰的两相，而当温度低于其浊点时，该水溶液为均一溶液，无法形成两相。两水相体系可通过对温敏型聚合物的回收实现该体系的回收再利用。
[0004]可再生两水相体系其含水量高，聚合物可被高效回收，与传统的有机溶剂萃取相比，该萃取条件温和，有效避免产品活性的损失。可再生型两水相体系具有绿色环保、操作安全且不需要进行防火防爆的特点。利用该两水相体系具有分配系数高，易实现绿色环保分离纯化单克隆抗体。
[0005]可再生型两水相萃取技术在生物大分子类药物生产方面具有独特优势与较好的应用前景，但形成可再生型两水相体系的响应型聚合物合成方法较为复杂，价格昂贵且不利于工业放大，两种响应型聚合物成相面临相分离时间过长，且工艺不够成熟，目前只停留在小试阶段，这极大限制了可再生型两水相体系的发展。
[0006]因此，利用单一热响应型聚合物构建可再生两水相体系可快速成相，目标物质在该体系中的分配系数高且该热响应型聚合物可被高效回收，利用绿色环保的方法分离纯化单克隆抗体成为本领域亟待解决的问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术主要针对上面的问题，提供了一种热响应型可再生两水相体系分离纯化单克隆抗体的工艺方法，该两水相体系成相聚合物为热响应型EO
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，其浊点为27℃，分子量为3KDa，诱导温度高于其浊点10℃以上可形成两水相，该聚合物为热响应型液态聚合物，相较于固态聚合物，该液态聚合物通过改变溶液温度可被高效回收，易于分相，成相时间短，并可显著降低单克隆抗体的分离纯化成本，易于实现绿色环保分离单克隆抗体的目标，且该技术易于工业放大。
[0008]为了实现上述的目的，本专利技术提供了一种分离纯化单克隆抗体的方法，其主要特点是，所述的方法包括：
[0009]正向萃取步骤：将EO
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与单克隆抗体细胞培养液按照1:3的体积比混合均匀，
并调节pH至9.0，静置于40℃水浴锅30分钟后，即可分成上下界面清晰的两相，取出离心，并将上相萃余液去除；
[0010]反向萃取步骤：加入与正向萃取步骤中的下相等体积的25mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系，并加入正向萃取步骤中加入的EO
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等体积的水，混合均匀并调节pH至4.5，静置于40℃水浴锅，直至形成上下界面清晰的两相，经过反向萃取，单克隆抗体富集于上相水溶液中。
[0011]较佳地，所述的单克隆抗体为依据利妥昔和曲妥珠单克隆抗体氨基酸序列，利用CHO系统表达生产的两种单克隆抗体。
[0012]较佳地，反向萃取步骤得到的下相，放置于50℃中按照1:1体积比加入0.1MNaOH溶液，加热30分钟，除去残留在EOPO中的杂质，回收热响应型聚合物EO
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。
[0013]本专利技术中所用的热响应型聚合物EO
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为市售品。
[0014]本专利技术的有益效果具体为：本专利技术设计了一种热响应型可再生EO
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/水两水相体系分离纯化单克隆抗体的工艺方法。其关键是所用的成相聚合物的循环回收率达到之前从未有的高，易于分相，且目标物分配系数也很高，满足工业使用要求。此两水相体系为热响应型，热响应型聚合物EO
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的回收率达99％以上；本专利技术提供了单克隆抗体的正向萃取工艺，EO
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与单克隆抗体的细胞培养液可控制在30分钟之内形成两相；单克隆抗体反向萃取工艺，EO
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与水可在30分钟之内形成两相。因此，通过控制体系温度形成两水相体系并可通过调节pH实现从单克隆抗体细胞培养中快速分离，大大降低了从细胞培养液中分离纯化单克隆抗体的成本，且成相时间短，操作便捷，易于工艺化应用。
具体实施方式
[0015]为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本专利技术的特征和优点，而不是对专利技术权利要求的限制。
[0016]实施例1热响应型可再生EO
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/水两水相体系正向萃取单克隆抗体的方法。
[0017]将单克隆抗体细胞培养液经过预处理，过滤离心后备用，首先在10mL离心管中加入2mL EO
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，再在其中加入6mL单克隆抗体细胞培养液并振荡混合均匀，调节溶液pH至9.0，并将其静置于40℃水浴锅中静置30分钟即可成相，取出后，用离心机以6000rpm离心3min。并用移液枪分别吸取上、下相100μL，并将其用超纯水稀释10倍至1mL，并按照市售试剂盒的IgG ELISA(酶联免疫法)试剂盒检测方法分别测定上下相中单克隆抗体的浓度。单克隆抗体在热响应型可再生EO
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/水两水相体系中正向萃取的分配系数为0.053。
[0018]实施案例2热响应型可再生EO
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/水两水相体系反向萃取单克隆抗体的方法。
[0019]将实施案例1离心管中的上相萃余液去除，并加入与EO
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等体积的25mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系，并加入正向萃取步骤中加入的EO
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等体积的水，将其振荡混合均匀后，调节pH至4.5，并将其静置于40℃水浴锅中静置30分钟可形成两相，取出后，用离心机以6000rpm离心3min。并用移液枪分别吸取上、下相100μL，并将其用超纯水稀释10倍至1mL，并按照市售试剂盒的IgG ELISA(酶联免疫法)试剂盒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用液态热响应型聚合物EO
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分离纯化单克隆抗体的方法，其特征在于，所述的方法包括：正向萃取步骤：将EO
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与单克隆抗体细胞培养液按照1:3的体积比混合均匀，并调节pH至9.0，静置于40℃水浴锅30分钟后，即可分成上下界面清晰的两相，取出离心，并将上相萃余液去除；反向萃取步骤：加入与正向萃取步骤中的下相等体积的25mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系，并加入正向萃取步骤中加入的EO
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等体积的水，混合均匀并调节pH至4.5，静置于40℃水浴锅，直至形成上下...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹学君，万俊芬，陈曦，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：