体内持续释放重组凝血因子Ⅷ及其制备方法技术

本发明专利技术提供了其中生物相容性聚合物与至少一个糖链的末端缀合的体内持续释放重组凝血因子VIII及其制备方法。根据本发明专利技术的体内持续释放重组凝血因子VIII具有通过比常规糖缀合技术更精细和更安全的方法修饰的蛋白质表面，并且具有免疫原性降低和体内持续性提高的优点。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】体内持续释放重组凝血因子VIII及其制备方法
本专利技术提供了体内长效重组凝血因子VIII及其制备方法，所述体内长效重组凝血因子VIII具有这样的结构，其中生物相容性聚合物与至少一个糖链的末端连接。
技术介绍
糖蛋白是指在表面上含有糖链的蛋白质，该糖链在蛋白质生产过程中在高尔基体中与蛋白质残基相连。在糖蛋白中，糖链的功能对蛋白质特性具有重要影响。例如，糖链可以改善蛋白质的水溶性，保护蛋白质免受蛋白酶的作用，降低蛋白质的免疫原性，决定蛋白质的细胞内转运的方向性和定位，或影响细胞间的相互作用(Functionand3DStructureoftheN-GlycansonGlycoproteins，Int.J.Mol.Sci.2012，13，8398-8429)。由于糖链的重要性，已经尝试通过糖工程来改善蛋白质特性。例如，对于促红细胞生成素(EPO)，向其引入两条额外的N糖链可以改善其在体内的半衰期(Glycoengineering：theeffectofglycosylationonthepropertiesoftherapeuticproteins，JPharmSci.200594(8)：1626-35)。另外，据报道，在癌细胞靶向抗体治疗的情况下，通过糖工程产生的缺少岩藻糖的抗体可以更好地诱导宿主的免疫应答并且具有更好的治疗效果(Productionoftherapeuticantibodieswithcontrolledfucosylation，MAbs.20091(3)：230-236)。这些使用糖工程的方法的优点在于可以使由副反应引起的副产物的产生最小化，并且与常规化学方法相比这样的方法是有效的。同时，关于通过改变糖链来改善糖蛋白特性的方法，已经尝试应用代谢糖工程，从而以更复杂的方式实现糖链的改变；但是，其具体应用和商业用途还不充分。
技术实现思路
技术问题本专利技术的一个目的是提供体内长效重组糖蛋白，其中生物相容性聚合物与引入到至少一个糖链的末端的唾液酸衍生物相连，优选提供凝血因子VIII，其中生物相容性聚合物与引入到至少一个糖链的末端的唾液酸衍生物相连。本专利技术的另一个目的是提供用于制备体内长效重组凝血因子VIII的方法，其中应用代谢标记技术，使凝血因子VIII的至少一个糖链的末端的唾液酸被修饰成引入了叠氮基或炔基的唾液酸衍生物。本专利技术的又一个目的是提供用于制备经修饰的体内长效重组凝血因子VIII的方法，其中通过将生物相容性聚合物到引入糖链末端的唾液酸衍生物来进行修饰。问题解决方案为了实现上述目的，在本专利技术的一个实施方案中，提供了一种体内长效重组凝血因子VIII，其包含与凝血因子VIII的至少一个糖链的末端的唾液酸衍生物连接的接头，其中所述接头由式1表示：其中R1和R2各自独立地为C1-8烷基、C6-12芳基、C3-6环烷基、3至10元杂环烷基、氨基、(氨基)C1-6烷基、(氨基)C3-6环烷基、(氨基)C6-12芳基、(氨基)(3至10元杂环烷基)、或5至12元杂芳基(其中所述杂环烷基和杂芳基可各自独立地包含选自N、S和O的至少一个杂原子，并且可各自独立地被选自卤素、C1-4烷基和CF3的至少一个取代基取代；并且所述氨基可被选自H、卤素、CN、C1-6烷基、卤代C1-3烷基或C1-6烷氧羰基的至少一个取代基取代)，或者R1和R2可彼此组合形成8至16元杂稠环(其中所述杂稠环可各自独立地包含选自N、S和O的至少一个杂原子，并且可各自独立地被选自卤素、C1-4烷基和CF3的至少一个取代基取代)；并且所述接头包含与R1、R2或当R1和R2彼此组合时形成的环中的至少一个连接的生物相容性聚合物。另外，在本专利技术的另一个实施方案中，提供了用于制备体内长效重组凝血因子VIII的方法，其包括以下步骤：(1)将包含编码凝血因子VIII的核苷酸的表达载体引入宿主细胞；以及(2)在补充有具有与其连接的第一官能团的唾液酸代谢物衍生物的培养基中培养所述宿主细胞，以获得在其至少一个糖链的末端引入了唾液酸衍生物的凝血因子VIII，所述唾液酸衍生物具有与其连接的第一官能团。另外，在本专利技术的另一个实施方案中，提供了用于制备体内长效重组凝血因子VIII的方法，其还包括以下步骤：(3)从所述培养基中除去所述唾液酸代谢物衍生物；(4)向所述培养基中添加具有与其连接的第二官能团和生物相容性聚合物的化合物，以允许进行点击反应；以及(5)收集在其至少一个糖链的末端连接有生物相容性聚合物的凝血因子VIII。专利技术的有益效果根据本专利技术的体内长效重组凝血因子VIII具有与存在于蛋白质表面上的糖链缀合的生物相容性聚合物(例如聚乙二醇)，从而可以降低体内糖蛋白凝血因子VIII本身的免疫原性，并且可以改善其体内长效性能。另外，根据本专利技术的用于制备体内长效重组凝血因子VIII的方法通过使用重组DNA技术利用了糖蛋白表达中目的宿主细胞的正常糖代谢过程，从而在糖链和生物相容性聚合物之间的缀合中具有高效和准确的优点。因此，与使用糖缀合技术转化糖蛋白糖链的常规方法相比，可以以稳定且高效的方式提供修饰的经重组凝血因子VIII。附图说明图1示出了实施例1.1中将scFVIIIG4B3转染到宿主细胞中时使用的表达载体的图。图2示出了实施例1.2中通过SDSPAGE分析scFVIIIG4_B3的纯化过程而获得的结果。(泳道1：分子量标记，泳道2：细胞培养基浓缩物，泳道3：VIII选择洗脱液，泳道4：纯化的scFVIIIG4B3)。图3示出了实施例2.1中的细胞培养过程及其每个循环的细节。图4A和4B分别示出了表达具有Ac4ManNA1(N-(4-戊酰基)-甘露糖胺四酰化)的scFVIIIG4B3的细胞系以及表达不具有Ac4ManNA1的scFVIIIG4B3的细胞系的生长曲线和scFVIIIG4B3的表达水平。图5示出了表达具有Ac4ManNAz的scFVIIIG4B3的细胞系以及表达不具有Ac4ManNAz(N-叠氮基乙酰甘露糖胺四酰化)的scFVIIIG4B3的细胞系的scFVIIIG4B3表达水平。图6A示出通过用SDSPAGE分析scFVIIIG4B3Az和纯化的scFVIIIG4B3Az的糖PEG化反应产物获得的结果(泳道1：分子量标记，泳道2：scFVIIIG4B3Az与20kDaDBCOPEG的反应产物，泳道3：scFVIIIG4B3Az与30kDaDBCOPEG的反应产物，泳道4：scFVIIIG4B3Az与40kDaDBCOPEG的反应产物，泳道5：纯化的scFVIIIG4B3Az)。图6B示出通过用SDSPAGE分析scFVIIIG4B3Az和纯化的scFVIIIG4B3Az的糖PEG化反应产物获得的结果(泳道1：分子量标记，泳道2：纯化的scFVIIIG4B3Az，泳道3：scFVIIIG4B3Az与10kDaDBCOPEG的反应产物)。图6C示出通过用SDSPAGE分析scFVIIIG4B3Az本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.体内长效重组凝血因子VIII，其包含与凝血因子VIII的至少一个糖链末端的唾液酸衍生物连接的接头，其中所述接头由式1表示：/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180112 KR 10-2018-00045891.体内长效重组凝血因子VIII，其包含与凝血因子VIII的至少一个糖链末端的唾液酸衍生物连接的接头，其中所述接头由式1表示：



其中R1和R2各自独立地为C1-8烷基、C6-12芳基、C3-6环烷基、3至10元杂环烷基、氨基、(氨基)C1-6烷基、(氨基)C3-6环烷基、(氨基)C6-12芳基、(氨基)(3至10元杂环烷基)、或5至12元杂芳基(其中所述杂环烷基和杂芳基可各自独立地包含选自N、S和O的至少一个杂原子，并且可各自独立地被选自卤素、C1-4烷基和CF3的至少一个取代基取代；并且所述氨基可被选自H、卤素、CN、C1-6烷基、卤代C1-3烷基或C1-6烷氧羰基的至少一个取代基取代)，或者R1和R2可彼此组合形成8至16元杂稠环(其中所述杂稠环可各自独立地包含选自N、S和O的至少一个杂原子，并且可各自独立地被选自卤素、C1-4烷基和CF3的至少一个取代基取代)；并且
所述接头包含与R1、R2或者当R1和R2彼此组合时形成的环中的至少一个连接的生物相容性聚合物。


2.根据权利要求1所述的体内长效重组凝血因子VIII，其中所述生物相容性聚合物是选自聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸(PSA)、聚唑啉、肝素前体的至少一种，及其组合。


3.根据权利要求2所述的体内长效重组凝血因子VIII，其中所述聚乙二醇的重均分子量为5至40kDa。


4.根据权利要求1所述的体内长效重组凝血因子VIII，其中式1的结构为选自式2至18及其异构体中的至少一种：















其中L可以是单键、卤素、C1-8烷基、C6-12芳基、-CO-、-R3CONR3-、-OCONR3-或-R3NCOR3-(其中R3可以各自独立地选自H、C1-4烷基和C6-12芳基)，并且X是生物相容性聚合物。


5.根据权利要求1所述的体内长效重组凝血因子VIII，其中式1的结构是选自式19至26的至少一种：









其中n是100至3,000的整数。


6.用于制备体内长效重组凝血因子VIII的方法，其包括以下步骤：
(1)将包含编码凝血因子VIII之核苷酸的表达载体引入宿主细胞；以及
(2)在培养基中培养所述宿主细胞，所述培养基补充有具有与其连接的第一官能团的唾液酸代谢物衍生物，以获得在其至少一个糖链的末端引入了唾液酸衍生物的凝血因子VIII，所述唾液酸衍生物具有与其连接的第一官能团。


7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一官能团是叠氮基或炔基。


8.根据权利要求6所述的方法，其中在步骤(2)中，所述唾液酸代谢物衍生物为选自式27至32的至少一种化合物，及其异构体：


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【专利技术属性】
技术研发人员：康官烨，金泰润，柳在奂，金然汀，金用栽，
申请(专利权)人：财团法人牧岩生命科学研究所，
类型：发明
国别省市：韩国;KR