用于制备高表达和高性能靶蛋白的表达盒及其用途制造技术

本发明专利技术涉及靶蛋白的表达盒、表达载体和转化体，表达盒包含启动子、编码该靶蛋白的多核苷酸、内含子序列和poly A序列。根据本发明专利技术的用于靶蛋白的表达盒能够通过一次转导同时进行内含子序列和靶蛋白的表达，并表现出通过调节内源基因的表达来诱导靶蛋白的高表达和高性能。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制备高表达和高性能靶蛋白的表达盒及其用途
本专利技术涉及用于制备高表达和高性能靶蛋白的表达盒及其用途。
技术介绍
动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，工业上广泛应用于重组蛋白的生产，尤其是治疗性蛋白质，例如抗体。使用哺乳动物细胞(如CHO细胞)产生的蛋白质经过翻译后修饰，然后进行糖基化，以实现完整的生物学活性。尽管与过去相比，表达载体、表达方法、培养技术等方面都有改进，使得用哺乳动物细胞(如CHO细胞)生产重组蛋白能够高浓度生产，但是需要使用昂贵的培养基，而且细胞的生长速率很慢，导致与使用微生物或酵母的生产相比，生产成本高。因此，在使用哺乳动物细胞生产重组蛋白时，从商业角度出发，有必要尽可能地提高生产能力。而且，当使用调节了特定内源基因的表达的动物细胞系生产重组蛋白，特别是治疗性抗体时，可以非常有效地用于提高生产能力或治疗效果并扩大治疗范围。例如，据报道，对于IgG型治疗性抗体，当连接至Fc区天冬酰胺297的聚糖中不存在岩藻糖时，自然杀伤细胞与抗体Fc区受体的结合力就会增强，从而增加抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)(Shields，RLetal.，TheJournalofBiologicalChemistry，277(30)，26733-26740，2002)。因此，当抑制将岩藻糖附着于抗体的Fc区域的天冬酰胺297的酶时，可以产生具有高抗体依赖性细胞毒性的治疗性抗体。为了提高重组蛋白的生产率并控制其质量，存在一种调节特定内源基因表达的方法。抑制内源基因表达的方法的实例可包括由于同源重组引起的基因敲除(Yamane-Ohnuki，N.等人，BiotechnologyandBioengineering，87(5)，614-622，2004)、RNA干扰包括使用具有与目标基因的mRNA互补的序列的RNA的目标基因的mRNA分解(Mori，K.等人，BiotechnologyandBioengineering，88(7)，901-908，2004)，等等。增加内源基因表达的方法可以包括通过转录具有强启动子的特定内源基因诱导高表达的方法。此外，已知从非编码DNA转录的小分子RNA(miRNA)具有调节蛋白质翻译的生物学功能，因此被报道为调节细胞功能和命运的新调节剂，并且已经有研究结果报道，为了控制细胞增殖和死亡，可使用此类miRNA在转录后调控过程中调控内源基因的表达(AmeliaCimminoetal，PNAS，102(39)，13944-13949，2005)。为了通过上述方法调节特定内源基因的表达，需要具有能够调节特定内源基因的遗传信息的表达载体，并且应该选择通过向动物细胞转染，内源基因稳定增加或被抑制的细胞系。为了选择这样的细胞系，具有内源基因调控信息的载体还包括选择标记的遗传信息。首先制备特定内源基因表达被调节的细胞系，然后另外用表达载体转染以表达重组蛋白，然后使用不同类型的选择标记从包含在载体中的重组蛋白中选择重组蛋白来调节特定内源基因的表达。由于此过程的复杂性，在同时调节多个内源基因表达的同时生产重组蛋白更加困难。作为增加重组蛋白生产力的另一种方法，可以使用内含子结构。内含子是在真核细胞中发现的序列，是在将通过RNA聚合酶转录的前体mRNA(pre-mRNA)通过剪接过程加工成成熟RNA的过程中除去的序列。已经有报道指出，通过使用内含子诱导的剪接过程可以增强蛋白表达(Herve’LeHir.等人，TrendsinBiochemicalSciences，28(4)，215-220，2003)。因此，为了克服在同时调节多个内源基因时出现的现有困难，本专利技术人已经专利技术了一种载体，在该载体中内含了调控内源基因表达的短发夹RNA(shRNA)序列，目标重组蛋白序列通过单个启动子转录并表达，从而最终完成本专利技术，其能够通过一次转染来调节多个内源基因的表达，从而诱导重组蛋白的高表达和高性能。
技术实现思路
技术问题常规的内源基因表达调节和靶蛋白产生，使用各自的表达盒，使得难以选择细胞系和适当地调节内源基因的表达。本专利技术的目的是提供一种靶蛋白表达盒，其包括启动子、编码该靶蛋白的多核苷酸、内含子RNA序列和polyA序列，以产生高表达和高性能目标蛋白。本专利技术的另一个目的是提供一种载体，其包括用于产生靶蛋白的表达盒。本专利技术的又一个目的是提供包含用于产生靶蛋白的表达盒的转化体。本专利技术的又一个目的是提供一种制备靶蛋白的方法，该方法包括培养包含表达盒的转化体以产生靶蛋白。技术方案本专利技术提供了用于产生靶蛋白的表达盒，其是包括启动子、编码靶蛋白的多核苷酸、内含子RNA序列和polyA序列的靶蛋白表达盒，其中内含子RNA序列包括剪接供体、分支和剪接受体。在本专利技术的一个实施方案中，靶蛋白可以是抗体或其部分片段。在本专利技术的一个实施方案中，至少一个内含子RNA序列存在于单个靶蛋白表达盒上。在本专利技术的一个实施方案中，表达盒可以包括选自以下的至少一种内含子RNA序列：a)至少一个位于启动子和编码靶蛋白的多核苷酸之间的内含子RNA序列；b)至少一个位于编码靶蛋白的多核苷酸和polyA之间的内含子RNA序列；c)至少一个位于启动子和编码靶蛋白的多核苷酸之间的内含子RNA序列和至少一个位于编码靶蛋白的多核苷酸和polyA之间的内含子RNA序列。在本专利技术的一个实施方案中，内含子RNA序列可以进一步包括用于靶基因表达调节的RNA序列。(在本专利技术的一个实施方案中，靶基因可以是选自以下的至少一种：FUT8(Alpha-1,6-fucosyltransferase)(α-1,6-岩藻糖基转移酶)、HDAC5(HistoneDeacetylase5),(组蛋白脱乙酰基酶5)、LDHA(LactatedehydrogenaseA)(乳酸脱氢酶A)、CXCR4(C-X-Cchemokinereceptortype4)(CXC趋化因子受体4型)、DHFR(Dihydrofolatereductase)(二氢叶酸还原酶)、PDK4(Pyruvatedehydrogenaselipoamidekinaseisozyme4)(丙酮酸脱氢酶脂酰胺激酶同工酶4)、MAPK3(Mitogen-activatedproteinkinase3)(丝裂原活化蛋白激酶3)、KANK4(KNMotifAndAnkyrinRepeatDomains4)(KN基序和锚蛋白重复结构域4)、PDI(Proteindisulfideisomerase)(蛋白质二硫键异构酶)、CNX(Calnexin)(钙连蛋白)、CRT(Calreticulin)(钙网蛋白)、elF2α(Non-phosphorylatableversionoftheeukaryotictranslationinitiationfactor2alpha)(真核翻译起始因子2α的非磷酸化版本)、ZFP-TF(Artificialzincfingerproteintranscriptionfact本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制备靶蛋白的表达盒，其包含启动子、编码该靶蛋白的多核苷酸、内含子RNA序列和poly A序列，其特征在于：所述内含子RNA序列包含剪接供体、分支和剪接受体。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171011 KR 10-2017-01299691.一种用于制备靶蛋白的表达盒，其包含启动子、编码该靶蛋白的多核苷酸、内含子RNA序列和polyA序列，其特征在于：所述内含子RNA序列包含剪接供体、分支和剪接受体。


2.根据权利要求1所述的用于制备靶蛋白的表达盒，其特征在于：所述靶蛋白是抗体或其片段。


3.根据权利要求1的用于生产靶蛋白的表达盒，其特征在于：至少一个内含子RNA序列存在于单个靶蛋白表达盒上。


4.根据权利要求1的用于生产靶蛋白的表达盒，其特征在于：用于生产靶蛋白的表达盒包含至少一种选自以下的内含子RNA序列：
a)至少一个位于启动子和编码靶蛋白的多核苷酸之间的内含子RNA序列；
b)至少一个位于编码靶蛋白的多核苷酸和polyA之间的内含子RNA序列；和
c)至少一个位于启动子和编码靶蛋白的多核苷酸之间的内含子RNA序列和至少一个位于编码靶蛋白和polyA的多核苷酸之间的内含子RNA序列。


5.根据权利要求1所述的用于制备靶蛋白的表达盒，其特征在于：所述内含子RNA序列进一步包含用于靶基因表达调节的RNA序列。


6.根据权利要求5所述的用于制备靶蛋白的表达盒，其中所述靶基因是选自以下至少一种：FUT8(α-1，6-岩藻糖基转移酶)、HDAC5(组蛋白脱乙酰基酶5)、LDHA(乳酸脱氢酶A)、CXCR4(CXC趋化因子受体4型)、DHFR(二氢叶酸还原酶)、PDK4(丙酮酸脱氢酶脂酰胺激酶同工酶4)、MAPK3(丝裂原活化蛋白激酶3)、KANK4(KN基序和锚蛋白重复结构域4)、PDI(蛋白质二硫键异构酶)、CNX(钙调蛋白)、CRT(钙网蛋白)、elF2α(真核翻译起始因子2α的非磷酸化版本)、ZFP-TF(人工锌指蛋白转录因子)、ATF4(激活转录因子4)、，GADD34(生长停滞和DNA损伤诱导蛋白34)、mTOR(哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白)、BIP(热休克70kDa蛋白5)、ATF6C(激活转录因子6C)、XBP1(X盒结合蛋白1)、BCL2(B细胞淋巴瘤2)、BCLxL(BCL2-样1)、BCL-xL的突变形式(Asp29Asn变体)、XIAP(X连锁凋亡抑制剂)、XIAP(EAX197)的突变形式、AVEN(凋亡、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂)、C-MYC(骨髓瘤病致癌基因)、FAIM(Fas凋亡抑制分子)、30Kc6(凋亡抑制30K蛋白)、TERT(端粒酶逆转录酶)、E1B-19K(对照蛋白E1B19K)、MDM2(鼠双突变2)、E2F1(E2F转录因子1)、HSP27(热激蛋白27)、HSP70(热激蛋白70)、MCL1(骨髓细胞白血病1)、AKT1(RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)、Beclin-1、ST6GAL(α2,6唾液酸转移酶)、GnT-IV(α-1,3-D-甘露糖苷β1,4N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶)、GnT-V(α1,6甘露糖苷β-1,6N乙酰基葡萄糖胺基转移酶)、ST3GAL(α2,3唾液酸基转移酶)、GalT(β1,4半乳糖基转移酶)、CMP-SAT(CMP-唾液酸转运蛋白)、CMP-SAS(CMP唾液酸合成酶)、GNE(突变尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡糖胺2-差向异构酶)、GnT-III(β1,4N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶III)、ManII(高尔基α-甘露糖苷酶II)、C2GnT(β1,6N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶)、RMD(GDP-6-脱氧-d-lyxo-4-己糖还原酶)、VHb(玻璃藻血红蛋白)、CPSI(氨基甲酸酯磷酸合成酶I)，OTC(鸟氨酸转氨甲酰酶)、PC(丙酮酸羧化酶)、GLUT5(葡萄糖转运蛋白5)、MDH2(苹果酸脱氢酶II)、TAUT(牛磺酸转运蛋白)、ALT1(丙氨酸氨基转移酶1)、XBP1(X-盒结合蛋白1)、XBP1s(XBP-1的剪接形式)、SLY1(缺失YPT1蛋白1的抑制子)、MUNC18C(突触融...

【专利技术属性】
技术研发人员：金满洙，金玟秀，曹钟文，张宸在，
申请(专利权)人：赛特瑞恩股份有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR