水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆及其构建方法和应用。该方法是将MEV复制形式的完整基因组进行酶切，以分段的形式依次定向克隆到基于载体pUC18‑M，获得重组质粒。将重组质粒与转染试剂混合后转染CRFK细胞，可获得拯救病毒。本发明专利技术利用反向遗传技术构建的水貂肠炎细小病毒感染性克隆在体外转染CRFK细胞，能够诱导细胞产生与亲本病毒相同的细胞病变和生长趋势。该方法简单、快速、省时省力，与传统PCR方法相比具有更高的准确性，应用该克隆系统能够快速便捷地在MEV基因组任意位置进行碱基突变，从而为后续研发MEV的分子生物学研究和疫苗的研制提供了有效的途径和手段。

Infective cloning of mink enteritis parvovirus genome and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆及其构建方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种利用反向遗传操作技术的水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆及其构建方法和应用。
技术介绍
水貂肠炎细小病毒(Minkenteritisparvovirus,MEV)可引起水貂病毒性肠炎，以胃肠黏膜出血和剧烈下痢为特征的高度接触性传染病，具有较高的发病率和死亡率，其中幼貂更易感。该病于上个世纪八十年代开始在我国暴发流行，给我国水貂养殖业造成了巨大的经济损失，也是世界公认的危害水貂养殖业的三大疾病之一。目前虽有疫苗用于水貂病毒性肠炎的预防，但在生产实践中该病仍较为多发，严重危害水貂健康。反向遗传技术是开展病毒学研究有效的分子生物学手段，在阐明病毒致病机制和疫苗的研制中发挥着重要的作用。利用反向遗传技术构建水貂肠炎细小病毒感染性克隆，使得在病毒的任意位点引入突变成为可能，方便对病毒的致病机制进行更加精细、准确的研究，从而在基因层面上对该病毒有更为深入的研究和了解，同时也是研制水貂肠炎病毒疫苗的一个有效途径，具有重大的兽医公共卫生学意义。根据GenB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆，其特征在于，所述克隆通过将水貂肠炎细小病毒完整基因组酶切后，以分段的形式依次定向克隆到载体pUC18-M得到。/n

【技术特征摘要】
1.一种水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆，其特征在于，所述克隆通过将水貂肠炎细小病毒完整基因组酶切后，以分段的形式依次定向克隆到载体pUC18-M得到。


2.如权利要1所述的水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆，其特征在于，所述的全基因组感染性克隆的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


3.一种水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述方法主要包括如下步骤：将水貂肠炎细小病毒复制形式的完整基因组进行酶切；将酶切后得到的两段基因片段，以分段的形式依次定向克隆到载体pUC18-M，获得重组质粒。


4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述载体pUC18-M由载体pUC18经酶切改造而成：首先使用HindⅢ酶切将环状质粒线性化，然后使用Blunting平端化酶处理将质粒DNA两端的粘性末端变为平末端。


5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，将水貂肠炎细小病毒接种CRFK细胞，当细胞生长旺盛且大部分肿胀变圆时收取细胞进行基因组提取，获得水貂肠炎细小病毒复制形式的完整基因组；用PstⅠ酶切基因组产生两个DNA片段。


6.如权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，具体步骤如下，
(1)载体pUC18改造
首先使用HindⅢ将pUC18线性化，然后使用Blunting平端化酶处理使载体片段两端由黏性末端变为平末端，命名为pUC18-M；将pUC18-M载体进行PstⅠ酶切使载体片段的一端变为黏性末端；
(2)MEV复制形式...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢之景，朱倩，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37