人源化细胞因子IL15基因改造非人动物的构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种人源化IL15基因改造非人动物的构建方法，利用同源重组的方式将编码人IL15蛋白的核苷酸序列导入动物基因组中，从而构建出基因修饰人源化动物，该动物体内能正常表达人或人源化IL15蛋白，促进人T细胞和NK细胞的发育，可以作为人IL15信号机理研究、肿瘤等疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

Construction method and application of human IL 15 gene transformation in non-human animals

【技术实现步骤摘要】
人源化细胞因子IL15基因改造非人动物的构建方法及应用
本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于基因编辑的IL15基因修饰人源化动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。
技术介绍
恶性肿瘤对人类的威胁日益增大。由于肿瘤的发生通常是潜伏的，诊断时，往往已经到了转移期或者晚期，因此该疾病的死亡率依然很高。目前对癌症的治疗主要是依靠手术、放疗和化疗，但是仍有70％的患者不仅没有达到预期的效果，反而饱受化疗副作用的折磨。随着生命科学的发展，恶性肿瘤细胞内的信号转导，细胞周期的控制，细胞凋亡的诱导，血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等基本过程正在被逐步阐明，特别是一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路，而肿瘤的细胞因子基因疗法也被广泛的应用在肿瘤的治疗中。IL15(interleukin-15)是1994年由Grabstein在检测猴肾内皮细胞株CV-1/EBDN的培养上清中发现并命名的重要可溶性细胞因子。人IL15基因定位于人染色体4q31位点，长32kb，有8个外显子，其中1、2外显子不编码，编码162个氨基酸，前导肽48个氨基酸，成熟蛋白由114个氨基酸组成，含有2个潜在的N-糖基化位点(N79，N112)，其受体亚基包括IL15Rα、βc(CD122)和γc(CD132)。IL15主要由树突细胞和巨噬细胞产生，是重要的促炎症因子，具有多种生物学功能。IL15是NK细胞发育的必需细胞因子，Lodolce等研究发现IL15α缺陷的小鼠多表现为先天免疫缺陷，包括脾脏中NK细胞数量的减少和细胞毒活性的降低；而IL15-/-表现为脾和肝脏NK细胞缺乏，加入外源性的IL15不仅可以增加脾脏中NK细胞百分比还可以增强NK细胞活性；IL15过表达小鼠中NK细胞的数量有显著的扩增。IL15还是T细胞生长因子；IL15R-/-小鼠的T细胞在向外周淋巴结归巢的过程中有缺陷，其胸腺和外周中CD8+T细胞数量不足，外源供给IL15小鼠情况好转，IL15是CD8+T细胞扩增和生存的关键；IL15能够维持T细胞CTLL-2生长、诱导细胞毒性T细胞活性、增强T细胞早期活化及增殖。除此之外，IL15对中性粒细胞、B细胞的分化等都具有重要作用。IL15与IL2的受体共用βc和γc链，通过βγ受体亚单位结合并活化Jak1和化Jak3，导致STAT-3和STAT-5活化并向细胞核定位，诱导bcl-2，活化MAP激酶信号通路，使Lck和和syk激酶磷酸化。因此IL15与IL2有许多相似的生物学功能，例如都能刺激T细胞和NK、LAK细胞的杀伤调节，但IL15/IL15Rα的转录本比IL2/IL12α有更广泛的组织表达，其细胞来源和靶细胞分布也更广泛。鉴于IL15的重要作用，本领域仍需要动物模型以对IL15进行进一步研究。小鼠与人类基因组非常相似，几乎所有的人类基因都可以在小鼠身上找到同源基因，因此小鼠成为良好的研究人类基因及疾病的动物模型，进一步的免疫缺陷型小鼠是体内研究人类细胞、组织、器官的极好的受体模型，在建立研究人体生物学和临床研究应用方面发挥着重要作用。NOD/SCIDIl2rg-/-免疫功能缺陷鼠通过进一步突变NOD/SCID小鼠白介素2受体gamma链(interleukin2receptorgammachain)，解决了NOD/SCID小鼠移植率低、寿命短的问题，成为公认免疫缺陷程度最高、移植率较好的小鼠，可以良好的运用在PDTX模型建立的研究。此类小鼠(NODSCIDIl2rg-/-)的IL-2Rγ链(白细胞介素2受体)的基因编码区完全敲除，对IL-2Rγ链的功能抑制更彻底，遗传背景更清晰，免疫缺陷程度更高，更适合人造血干细胞、外周血单核细胞、人肿瘤细胞和组织等的移植和生长。除可用于人源细胞移植生长以外，还可与多种细胞因子基因人源化小鼠配合用于新的人源化动物模型研发与药效检测应用等方面。但是NOD/SCIDIl2rg-/-鼠普遍缺乏能够正常发育的人类T细胞和NK细胞，当植入来自脐带血的造血干细胞，人NK和T细胞的分化效率较低，尤其是移植人成熟外周血时，人NK细胞只能保持很短的时间。这一缺陷限制了NOD/SCIDIl2rg-/-免疫功能缺陷鼠在临床和药物筛选上更广泛的应用。进一步的，本领域仍然需要免疫缺陷程度高，同时能够促进人类T细胞和NK细胞正常发育、应用更广泛的动物模型。
技术实现思路
本专利技术的第一方面，提供了一种人源化IL15基因改造非人动物的构建方法，所述的人源化IL15基因改造非人动物体内表达人或人源化IL15蛋白。优选的，所述的人源化IL15基因改造非人动物的基因组中包含人IL15基因的全部或部分核苷酸序列。优选的，所述的人源化IL15基因改造非人动物的基因组中包含至少一个人IL15基因的外显子。更优选的，所述的人源化IL15基因改造非人动物的基因组中包含人IL15基因的3号外显子至8号外显子的全部或部分核苷酸序列。其中，所述的3号外显子至8号外显子的部分为至少30、60或90个与人IL15基因的核苷酸序列相同，且人源化IL15基因改造非人动物体内产生的IL15蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。进一步优选的，所述的人源化IL15基因改造非人动物的基因组中包含人IL15基因的3号外显子核苷酸序列、4号外显子核苷酸序列、5号外显子核苷酸序列、6号外显子核苷酸序列、7号外显子核苷酸序列或8号外显子核苷酸序列中的任一种或两种或三种以上的组合。所述的三种以上包括三种、四种、五种或六种。再进一步优选的，所述的人源化IL15基因改造非人动物的基因组中包含人IL15基因的3号外显子核苷酸序列、4号外显子核苷酸序列、5号外显子核苷酸序列、6号外显子核苷酸序列、7号外显子核苷酸序列或8号外显子核苷酸序列中的连续两个或连续三个以上外显子核苷酸序列的组合。所述的连续三个以上包括连续连续三个、连续四个、连续五个或连续六个。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化IL15基因改造非人动物的基因组中包含人IL15基因的3号外显子的部分核苷酸序列，4号外显子的全部核苷酸序列、5号外显子的全部核苷酸序列、6号外显子的全部核苷酸序列、7号外显子的全部核苷酸序列和8号外显子的部分核苷酸序列。其中，所述的3号外显子的部分核苷酸序列为从3号外显子ATG编码序列开始，至所述的外显子8编码序列至TAG。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化IL15基因改造非人动物的基因组中包含编码人或人源化IL15蛋白的核苷酸序列和辅助序列；优选的，所述的辅助序列为WPRE和/或polyA。优选的，所述的非人动物体内不表达内源IL15蛋白或内源IL15表达量降低。优选的，所述的非人动物体内表达人IL15蛋白。优选的，所述的构建方法中使用基因编辑技术进行人源化IL15基因改造非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源化IL15基因改造非人动物的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL15基因改造非人动物体内表达人或人源化IL15蛋白。/n

【技术特征摘要】
20181225 CN 2018115980443;20190626 CN 2019105601441.一种人源化IL15基因改造非人动物的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL15基因改造非人动物体内表达人或人源化IL15蛋白。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL15基因改造非人动物的基因组中包含人IL15基因的全部或部分核苷酸序列，优选的，所述的人源化IL15基因改造非人动物的基因组中包含至少一个人IL15基因的外显子；进一步优选的，所述的人源化IL15基因改造非人动物的基因组中包含人IL15基因的3号外显子至8号外显子的全部或部分核苷酸序列；更进一步优选的，所述的人源化IL15基因改造非人动物的基因组中包含编码人或人源化IL15蛋白的核苷酸序列和辅助序列，其中，所述的辅助序列优选为WPRE和/或polyA。


3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括使用靶向载体将编码人IL15蛋白的核苷酸序列和辅助序列插入非人动物内源调控元件之后，使得所述非人动物体内表达人或人源化IL15蛋白；
其中，所述的靶向载体包含供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的供体DNA序列包含人IL15基因的全部或部分核苷酸序列。


4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000074.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述5’臂核苷酸序列如SEQIDNO：7所示；或者，所述的靶向载体包含与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000074.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述3’臂核苷酸序列如SEQIDNO：8所示。


5.根据权利要求1-4任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括使用靶向内源IL15基因的sgRNA序列，所述的sgRNA序列在待改变的IL15基因上的靶序列上是唯一的，所述sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQIDNO：10-19任一项所示，3’端靶位点序列如SEQIDNO：20-28任一项所示。


6.根据权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL15基因改造非人动物的基因组中包含嵌合IL15基因，所述的嵌合IL15基因编码人或人源化IL15蛋白，所述的嵌合IL15基因编码的氨基酸序列选自下列组中的一种：
a)为SEQIDNO：4所述氨基酸序列的部分或全部；
b)与SEQIDNO：4所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)与SEQIDNO：4所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
d)具有SEQIDNO：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。


7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述嵌合IL15基因中来源于人IL15基因的部分核苷酸序列选自下列组中的一种：
a)为SEQIDNO：51所示的核苷酸序列的全部或部分；
b)与SEQIDNO：51所示的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)与SEQIDNO：51所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
d)具有SEQIDNO：51所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
e)为SEQIDNO：9所示的核苷酸序列的全部或部分；
f)与SEQIDNO：9所示的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
g)与SEQIDNO：9所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
h)具有SEQIDNO：9所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。


8.根据权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于，所述的嵌合IL15基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：
a)与SEQIDNO：6所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
b)与SEQIDNO：6所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
c)具有SEQIDNO：6所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
d)转录的mRNA序列与SEQIDNO：5所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
f)转录的mRNA序列在严格条件下，与SEQIDNO：5所示的核苷酸序列杂交；
g)转录的mRNA序列与SEQIDNO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
h)转录的mRNA序列具有SEQIDNO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
i)转录的mRNA序列中来源于人IL15基因的部分为与SEQIDNO：3所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
j)转录的mRNA序列中来源于人IL15基因的部分在严格条件下，与SEQIDNO：3所示的核苷酸序列杂交；
k)转录的mRNA序列中来源于人IL15基因的部分为与SEQIDNO：3所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
l)转录的mRNA序列中来源于人IL15基因的部分为具有SEQIDNO：3所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。


9.一种IL15基因经遗传修饰的细胞，其特征在于，所述的细胞表达人或人源化IL15蛋白。


10.根据权利要求9所述的细胞，其特征在于，所述细胞的基因组中包含人IL15基因的全部或部分核苷酸序列。


11.一种IL15基因的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体DNA序列，所述的供体DNA序列包含人IL15基因的全部或部分核苷酸序列；优选的，所述的供体DNA序列包含编码人IL15蛋白的核苷酸序列。


12.根据权利要求11所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000074.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述5’臂核苷酸序列如SEQIDNO：7所示；或者，所述的靶向载体包含与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000074.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述3’臂核苷酸序列如SEQIDNO：8所示。


13.根据权利要求11或12所述的靶向载体，其特征在于，所述的供体DNA序列包含SEQIDNO：51；优选的，所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，张美玲，姚佳维，郭朝设，郭雅南，白阳，黄蕤，赵磊，
申请(专利权)人：百奥赛图江苏基因生物技术有限公司，北京百奥赛图基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32